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Responsabile Daniele Sblattero
Settore di ricerca Biologia Applicata
Personale docente Claudio Santoro  Diego Cotella 
Personale non-docente Silvia Saragozza  Szilvia Bako  eleonora rizzato  Frank Antony            
Obiettivi della ricerca 1) Identificazione di nuovi marker diagnostici nel carcinoma ovarico
Risultati ottenuti 1)  L’approccio di ricerca prevede l’integrazione delle seguenti tecnologie emergenti: i) la tecnica del phage display per la creazione di repertori proteici; ii) il sequenziamento massivo di nuova generazione per l’identificazione in maniera rapida dei cloni antigenici; iii) i microarray proteici per una analisi complessiva dell’autoimmunoma.

Come primo passo, abbiamo caratterizzato fluidi ascitici da pazienti con carcinoma ovarico e di controllo per evidenziare la presenza di una risposta anticorpale specifica contro proteine tumorali. Le asciti sono state analizzate mediante vari test immunologici per la reattività contro proteine intracellulari come pure di superficie espresse in cellule di carcinoma ovarico OVCAR. Queste valutazioni hanno permesso di evidenziare che le asciti provenienti da carcinomi ovarici contengo un elevato titolo di anticorpi diretti contro proteine tumorali mentre questa risposta non è presente nei campioni di controllo.
Il secondo passaggio ha previsto la purificazione e l’utilizzo di questi anticorpi, derivati dalle asciti tumorali, per selezione proteine antigeniche da una libreria proteica espressa su fagi filamentosi.
Nel successivo passaggio centinaia di peptidi/antigeni selezionati sono stati prodotti come proteine ricombinanti e utilizzato per costruire un protein microarray. Questi array sono stati infine soggetti ad un immuno-screening con un "discovery set" di anticorpi da ascite tumorale e non.
L’analisi ha portato alla identificazione di 8 antigeni che risultano come i più reattivi tra le centinaia analizzati.
Infine gli otto antigeni sono stati validati mediante test ELISA con un nuovo set di asciti “validation set” che ha permesso di validare le potenzialità di questo insieme di antigeni tumore-associati e definire quella che prende il nome di "firma anticorpale" della malattia.
Questi potenziali biomarcatori presenti nei fluidi biologici sono in grado di distinguere i campioni derivanti da pazienti da quelli derivanti dai controlli. La combinazione di questi marcatori in test multiplex permette di aumentare la sensibilità di rilevazione raggiungendo una sensibilità combinata del 63% e specificità del 82-100%. Pertanto il nostro approccio ha un grande potenziale per lo sviluppo di strumenti innovativi per la diagnosi, la prognosi, e la terapeutica di patologie legate ad una risposta anticorpale. 
Obiettivi della ricerca 2) Identify novel TG2 extracellular binding partners and confirm known interactions.
Risultati ottenuti 2)  An high quality CDNA phage display library have been constructed and fully characterized by next generation sequencing. The library contains over 10.000 different genes. A selection of this cDNA display library, to recombinant TG2, followed by massive gene sequencing with 454 system have been performed. Ranking and analysis of more than 120,000 sequences allowed us to identify 24 potential substrates and interactors, which were subsequently confirmed in functional assays. Within the identified clones, some had been previously described as interacting proteins, while others were new. 4 extracellular proteins are now being validated for their interaction with TG2 by ELISA, FACS and IF.
 
Obiettivi della ricerca 3) On demand antibody array development
Risultati ottenuti 3)  Antibody array generation involves obtaining the clones, expression and purification of the proteins and finally their spotting onto the microarray surface. Even in a low throughput applications with only few dozen of antibodies the expression of clones and the purification of the proteins are time- and cost-intensive. Furthermore the spotting process itself is also suboptimal, when deposited and dried on a substrate antibodies are prone to unfolding leading to a less reliable interaction measurements. All the issues associated with first generation protein arrays have been recently addressed by an elegant technological developments that allow the production of “on demand protein arrays”. By coupling the spotting of DNA and the in situ in vitro transcription/translation (IVTT) the array is obtained just when needed. In this approach what it is immobilized on the chip are the plasmids containing the cDNAs of interests in combination with an capturing agent. Usually the protein is expressed as GST fusion protein and the capture protein is an anti GST antibody. When the chip is overlaid with an in vitro transcription and translation expression mixture, this causes expression of the protein and its capture “in situ” on chip surface via the GST domain.

We have recently start to addressed some of the issues needed to provide an improved system to build stable antibody arrays. To accomplish covalent biding to the chip surface we have exploited the A. tumefaciens virulence proteins VirD2. VirD2 can couple itself covalently to single-stranded DNA comprising the 13 nucleotide recognition sequence called T-Border. We have designed a novel vector were each protein of interest is synthesized as a VirD2 fusion protein that once expressed binds to a specific oligonucleotidi containing the T-border sequence. By using this strategy we were able to substitute the capture reagent by a simple oligonucleotidi DNA fragments, therefore only DNA will be printed on the array simplifying fabrication and improving stability. 
Collaborazioni in atto Dr. Andrew Bradbury LANL Los Almos New Mexico US 
Comunicazioni a congressi   
Pubblicazioni
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N-glycosylation of the mammalian dipeptidyl aminopeptidase-like protein 10 (DPP10) regulates trafficking and interaction with Kv4 channels.
Treatment of experimental arthritis by targeting synovial endothelium with a neutralizing recombinant antibody to C5.
Simple scale-up of recombinant antibody production using an UCOE containing vector.
RhoB is associated with the anti-angiogenic effects of celiac patient transglutaminase 2-targeted autoantibodies.
A single conformational transglutaminase 2 epitope contributed by three domains is critical for celiac antibody binding and effects.