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Responsabile Mara Giordano
Settore di ricerca Genetica Medica
Personale docente    
Personale non-docente Ileana Fusco  Deepak Babu  Simona Mellone  Barbara Fre  Stefania Nebuloni         
Obiettivi della ricerca 1) Analisi funzionale di varianti identificate nel gene codificante l`ormone della crescita
Risultati ottenuti 1)  Autosomal dominant GH deficiency is mainly caused by mutations influencing the correct mRNA splicing, occurring at the IVS3 donor splice site and within an ESE located in the first 7bp of exon 3(ESE1). These mutations result in an increased level in the production of the exon 3-skipped isoform encoding the dominant negative 17.5 kDa isoform (normally present at low concentration) and variable level of the wild type 22 KDa isoform. Another ESE(ESE2) was identified by in vitro mutagenesis spanning from nt 19 to nt 32. We identified three IGHD patients carrying variations in Exon 3. One carried the non-synonymous variation E3+75G>A (Glu82Asp), the second carried two novel variations, E3+90P>P (Pro87Pro)and E3+101E>V(Glu91Val)and the third patient carried two synonymous variations at E3+90P>P (Pro87Pro) and E3+84P>P (Pro85Pro). These mutations were absent in a panel of 400 normal chromosomes. All the mutations were originated by gene conversion from one of the GH cluster homologous genes. None of them was included in the already identified ESEs. The ESE Finder software suggested the presence of two other ESEs in exon 3 from nt 83 to 89(ESE3)and nt 98 to 104 (ESE4). The mutations at position nt 84 and nt 101 were predicted to abolish ESE3 and ESE4, respectively. We performed in vitro splicing analysis with constructs bearing the entire wild type GH (GHwt) gene, and the GH gene carrying the different mutations identified in the three patients (GH82, GH85, GH87, GH91). The mRNAs from transfected GH4C1 rat pituitary cells showed the wild type 22 KDa isoform in all the constructs. GHwt and GH82 showed the full length and the exon3 skipped bands of similar intensity (the 17.5 KDa was visible as a faint band). Conversely, the GH85 and GH91 transcripts produced significantly higher level of the band corresponding to the 17.5 KDa isoform as compared to the GHwt. The 17.5kDa isoform was completely absent in the GH87 mRNA. In conclusion we identified two novel ESEs in the GH exon3 through the detection of mutations in IGHD patients. Two of these mutations E3+84P>P(GH85)and E3+101E>V (GH91) cause an increased level of the 17.5 KDa protein. Further analysis are necessary to better understand the role of these mutations. The analysis of the parents of the patients will reveal whether the mutations were inherited from the same parent or one from each parent or if they are de novo mutations. 
Obiettivi della ricerca 2) Ricerca di nuovi geni coinvolti nel deficit di GH mediante sequenziamento dell`intero esoma in famiglie affette.
Risultati ottenuti 2) In our laboratory experience the geneticc defect has been elucidated only in a small proportion of sporadic GHD cases (3.6%) and a higher but still limited proportion of familial cases (5 out of 23, 21%, considering GHD and ISS)and these data are in agreement with the literature. It is likely that, at least in a subset of the remaining patients, the disease is determined by mutations in still unidentified genes.
In order to discover novel genes involved in the growth process and carrying mutations causing ISS and GHD, we are planning to perform whole-exome sequencing on the affected members of the 18 families in which the genetic causes of short stature remained unidentified by conventional approaches.
A family-based sequencing approach should actually allow an easier filtering and prioritization of the variants identified by massive parallel sequencing by focusing on those segregating with the condition. If the inheritance model of the disease in the family suggests a recessive condition, sequencing of the affected subjects should allow us to focus on those variants present at the homozygous state in all the individuals we sequenced, or those variants for which patients are compound heterozygotes. If the family tree suggests a dominant model of inheritance, by sequencing affected and unaffected subjects, we should be able to filter-out those variants, likely to be unrelated with the disease, found at the heterozygous state in the probands and in their healthy relatives, and to focus on those segregating with the disease. The possibility of incomplete penetrance will be taken into consideration and a re-evaluation of the family will be considered on the basis of preliminary exome data.
In collaboration with the University of Pavia whole exome sequencing have been already partially performed in two families. One family is composed of three affected sibs born to consanguineous parents, suggesting an autosomal recessice mode of inheritance. The second family is composed of four sibs of which three IGHD, and the inheritance is likely autosomal dominant as the father in short <-2SDS, (but not already tested for GH levels) and he has short relatives.
The variants identified have been considered on the basis of their presence and allele frequency in publicly available genomic variants databases such as dbSNP and Exome Variant Server Database (url: http://snp.gs.washington.edu/EVS/; NHLBI Exome Sequencing Project (ESP), Seattle, WA), as well as in uncorrelated samples included in our in-house database, filtering out those likely to be common in the general population. The model of inheritance has been taken into consideration for each of the two families.
To date we have sequenced one of the three sibs (#1047) belonging to the consanguineous family (pedigree #7) and the all three affected sibs (#4953, #4954 and #4955) of the second family
In sample # 1047 after filtering for common variations we identified 243 variations at the homozygous state in 177 different genes of which 145 in the UTRs and 27 intronic in postions not relevant for the splicing. Sixty-seven homozygous variations were exonic of which 63 non-synonimous (61 missense and 2 nonsense) and 4 synonymous. As none of the identified genes is an obvious candidate gene we decide to design the primers for the all the 63 non-synonymous variations in order to confirm them through Sanger sequencing and contemporarily to test them in the other two sibs and in the parents to select only those for which the three sibs are homozygous and the parents heterozygous.
The three affected sibs of family #11 share 98 rare variations (filtered...) in 98 genes at the heterozygous state (dominant model) of which 48 exonic (one non-sense, three in frame del/ins and 44 missense). Also in this case no obvious candidate gene is present among the selected genes. We will start by testing the predicted damaging variations in the rest of the family members (unaffected sister and the affected father) according to the disease segregation in order to restrict the number of candidate variants.
 
Obiettivi della ricerca 3) Identificazione di geni coinvolti nel deficit di GH mediatricerca di microriarrangiamenti sul cromosoma X.
Risultati ottenuti 3)  Lo scopo di questo progetto, in collaborazione con l’Università di Pavia, è l’identificazione di fattori genetici coinvolti nella bassa statura associata a deficit ormone della crescita (GH). In particolare lo studio proposto era focalizzato sul cromosoma X. Due serie di osservazioni inducevano a ipotizzare la presenza su questo cromosoma di uno o più geni coinvolti nel deficit di GH: l’eccesso di pazienti maschi rispetto alle femmine (in media in rapporto 2:1) e l’identificazione mediante citogenetica classica di estesi riarrangiamenti genomici che coinvolgono la regione Xq13-q21, in pazienti maschi con bassa statura e altre anomalie.
La prima fase dello studio consisteva nell’analisi di pazienti maschi affetti da deficit di GH mediante array CGH (aCGH) con una piattaforma customizzata al fine di identificare microriarrangiamenti sul cromosoma X.
E’ stata disegnata, mediante il tool e-array di Agilent (https://earray.chem.agilent.com/earray/) una piattaforma aCGH con sonde oligonucleotidiche ad alta densità lungo tutto il cromosoma X. Per la regione Xq13q21 è stata prevista una densità maggiore, con almeno una sonda ogni 5 kb, mentre per il resto del cromosoma X la densità è di una sonda ogni 10 kb. Inoltre sono state aggiunte alla piattaforma altre regioni del genoma contenenti geni noti per essere coinvolti nel deficit di GH e nello sviluppo dell’ipofisi. La prima fase dello studio è consistita nell’analisi del DNA di 24 pazienti CPHD sporadici di sesso maschile. Tutti i campioni e i DNA di riferimento sono stati processati in accordo alle istruzioni del produttore (Agilent). I campioni che hanno passato il controllo di qualità sono stati analizzati e visualizzati graficamente mediante il software Genomic Workbench 5.0 (Agilent). La chiamata del riarrangiamento (delezione o duplicazione) veniva effettuata solo in presenza di almeno tre sonde con dei valori di rapporto logaritmico significativamente diversi da 0 (log ratio di -1 per le delezioni e 0.5 per le duplicazioni). L’interpretazione dei dati ottenuti è stata condotta utilizzando come riferimento database pubblici quali UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), e il Database of Genomic Variants (http://projects.tcag.ca/variation/).
Tre dei 24 casi processati non ha superato il controllo di qualità e dunque non è stato possibile analizzarli. In 12 casi sono state riscontrate solamente delle CNVs (Copy Number Variants) polimorfiche che con elevata probabilità non sono correlate alla patologia e sono riportate nel Database delle Varianti Genomiche (Database of Genomic Variants, DGV).
Abbiamo identificato in 9 casi una o più CNV candidate per essere correlate alla patologia: in tabella 5 sono riportati i dati ottenuti dall’analisi dei 9 campioni in cui è stato identificato almeno un riarrangiamento (per un totale di 10) non presenti nel DGV.
In nessun paziente è coinvolta la regione Xq13q21. Tuttavia sono state identificate delle CNVs localizzate nella porzione distale del cromosoma X in tre pazienti (#2155, #2043, #2149). E’ interessante notare che in due di questi, era presente una piccola delezione in Xq27, a livello di regioni non-codificanti situate circa 83 kb a monte e 340 kb a valle del gene SOX3. Mutazioni e CNVs in SOX3 sono state descritte in pazienti IGHD e CPHD con fenotipo variabile, in alcuni casi associato a ritardo mentale. Inoltre sono riportate CNV in regioni non codificanti nelle vicinanze di SOX3 e SOX9 (ad esso strettamente correlato) di cui è dimostrato un ruolo nella deregolazione dell’espressione genetica che determinano un fenotipo clinic. La nostra ipotesi è che in questi soggetti la presenza di delezioni determini una misregolazione di SOX3.
La terza variante sul cromosoma X è una duplicazione del gene MAGEA8, localizzato nella regione Xq28, codificante per un membro della famiglia MAGEA (melanoma antigen) situata in Xq28. Questi geni sono associati ad alcune patologie come la discheratosi congenita. E’ tuttavia improbabile un ruolo di questa duplicazione nel deficit di GH anche perché essa è riportata nel DGV database, sebbene non sia riportato il sesso dei soggetti analizzati. Tra i riarrangiamenti identificati nelle vicinanze di geni candidati al di fuori del cromosoma X il più interessante sembra essere la delezione 51 kb a monte di POU1F1. Anche in questo caso potrebbe verificarsi un’alterazione della regolazione dell’espressione genica a lunga distanza del gene POU1F1.
Per 8 dei 10 riarrangiamenti selezionati come potenzialmente rilevanti, abbiamo messo a punto un sistema basato su una differente metodica per validarne l’effettiva presenza nel paziente in cui era stata individuata mediate aCGH.
Delle 8 varianti testate con MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplificatio), due non sono state confermate: la delezione sul cromosoma 3 a 345 Kb da POU1F1 (#1185) e la delezione intragenica in LHX4 (#2164).
Le varianti validate sono state testate in un gruppo di pazienti e in un gruppo di individui sani di controllo per un totale di circa 100 individui. Nessuna delle delezioni/duplicazioni è stata identificata in pazienti CPHD (circa 60) e IGHD (3 pazienti sino ad ora testati). La duplicazione nella regione Xq28 riscontrata nel paziente # 2155 è stata identificata anche in un soggetto sano, confermando il nostro sospetto di non causalità di questa variante (anche presente in DGV).
In conclusione in questa prima fase del nostro studio abbiamo identificato 5 varianti rare di cui due delezioni sul cromosoma X che potrebbero essere la causa della patologia in 5 dei 21 pazienti CPHD) di cui è stato possibile ottenere risultati attendibili con la piattaforma aCGH utilizzata.
Per ciascuna di queste è in corso l’analisi su un ulteriore numero di pazienti con GHD e di controlli per valutare l’opportunità di procedere con studi funzionali.
 
Obiettivi della ricerca 4) Ricerca di mutazioni nel gene HMGA2 nella Bassa Stature Idiopatica (ISS)
Risultati ottenuti 4)  Earlier known as HMGIC, HMGA2 encodes a protein that belongs to the non-histone chromosomal high-mobility group (HMG) protein family. HMGA2 is located on chromosome 12q14 and contains 3 AT-hook motifs, involved in DNA binding, encoded by the first 3 exons; a 11-amino acid sequence characteristic of HMGA2 and absent in the other family proteins (linker domain) encoded by exon 4 and part of exon 5; and an acidic C-terminal domain encoded by the fifth exon .
We investigated HMGA2 because previous GWAS studies independently confirmed that 3 SNPs (rs1042725, rs7968682 and rs7968902) in the high mobility group-A2 gene (HMGA2) are common variants influencing human height across different populations (9Takeshita H. et al. 2011). All of these three SNPs are located within the 3′-UTR region of HMGA2, which may directly or indirectly influence the mRNA stability of HMGA2. Moreover the gene was considered as a strong biologic candidate for height because loss of function of HMGA2 in the mouse results in the pygmy phenotype that combines pre and postnatal growth failure, with resistance to the adipogenic effect of overfeeding (8Mari F. et al. 2009).
In humans CGH-Array results showed that patients with a microdeletions on the chromosomal region 12q14 of different size have as common features short stature. The Critical Region in patients with severe short stature include the HMGA2 gene (Figure 1, 10Lynch S.A. 2011).
The HMGA2 has never been screened for the presence of mutation in ISS patients. Thus this gene could be considered a good candidate for the presence of point mutations in cases in which mutations in SHOX gene have been excluded. This is the first study based on HMGA2 sequence analysis in a large cohort of ISS patients.
ResultsAll the exons and the splicing junctions of the novel candidate gene HMGA2 were sequenced in 58 short stature patients, in which mutations in SHOX were excluded.
The mutation analysis in our patients did not show any sequence changes suggesting that mutations in this gene are not a frequent cause of ISS. However we will expand the number of cases and on all the patients we will perform a multiplex ligation probe amplification (MLPA) to detect deletions of the whole HMGA2 gene and of single exons.

 
Collaborazioni in atto   
Comunicazioni a congressi   
Pubblicazioni
Functional SNPs within the intron 1 of the PROP1 gene contribute to combined growth hormone deficiency (CPHD).
Association of the (CA)n repeat polymorphism of insulin-like growth factor-I and -202 A/C IGF-binding protein-3 promoter polymorphism with adult height in patients with severe growth hormone deficiency.