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Responsabile Renzo Boldorini
Settore di ricerca Anatomia Patologica
Personale docente Guido Monga  Oscar Alabiso 
Personale non-docente Umberto Miglio  Sara Allegrini  Rosanna Mezzapelle  Alessia Paganotti  Claudia Veggiani  Ylenia Antona  Elena Maldi  Maria Scatolini
Obiettivi della ricerca 1) Valutazione dello stato mutazionale nelle vie di trasduzione del segnale a valle di EGFR nel mesotelioma pleurico maligno
Risultati ottenuti 1) Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è una patologia con un alto grado di aggressività che origina dalle cellule della membrana sierosa pleurica, fortemente correlata con l’esposizione all’asbesto. In Italia il MPM ha una incidenza di circa 2 casi su 100.000 abitanti, con un aumento nelle aree in cui sono presenti attività produttive legate all’uso dell’amianto, come nella zona di Casale Monferrato in Piemonte. Nel corso del 2011 è stato iniziato uno studio retrospettivo di pazienti affetti da MPM afferenti presso l’ospedale Maggiore della Carità di Novara. Lo scopo di tale studio è quello di valutare sia l’efficacia delle attuali linee terapeutiche, sia di determinare la possibile somministrazione di farmaci attualmente in uso nel carcinoma polmonare e colico. Sono stati quindi selezionati campioni di MPM con caratteristiche epiteliomorfe, su cui è stata condotta indagine immunoistochimica e di Real Time PCR per valutare l’espressione delle proteine Timidilato Sintasi (TS) e Excision Repair Cross Complementing group-1 (ERCC1), proteine coinvolte nella resistenza ai farmaci Pemetrexed e Cisplatino. Successivamente sono stati analizzati i geni codificanti per EGFR, BRAF e PI3K coinvolti nelle vie di trasduzione del segnale e responsabili della risposta a farmaci a bersaglio molecolare diretti contro EGFR. Nel corso del 2011 sono stati analizzati 17 pazienti affetti da MPM di cui 16 trattati con Cisplatino (n=4) o Cisplatino associato a Pemetrexed (n=12). Quattro di questi pazienti risultano deceduti, senza però mostrare una correlazione statistica tra decesso e trattamento farmacologico (p=0,17). Non è stata inoltre evidenziata correlazione tra espressione di mRNA di ERCC1 e sopravvivenza (p=0,41), mentre l’espressione proteica di TS, nonostante il dato statistico non sia significativo (p=0.06), sembra avere una associazione con la sopravvivenza generale dei pazienti. L’indagine mutazionale non ha invece mostrato mutazioni a carico dei geni analizzati, indicando che EGFR non sembra avere un ruolo nella cancerogenesi dei MPM epiteliomorfi. Sono in corso indagini su ulteriori proteine coinvolte nella cascata di segnale e verrà aumentata la casistica al fine di ottenere dati statistici più significativi.
 
Obiettivi della ricerca 2) Analisi delle mutazioni di EGFR negli adenocarcinomi polmonari in preparati citologici
Risultati ottenuti 2) Il trattamento farmacologico attualmente in uso per la cura di pazienti affetti da tumore al polmone non a piccole cellule prevede l’utilizzo di farmaci a bersaglio molecolare inibitori del dominio tirosin-chinasico dell’Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), in particolare Erlotinib e Gefitinib. Recenti studi hanno mostrato che la presenza di mutazioni nel gene codificante per EGFR sono indicative per la risposta alla terapia. La metodica maggiormente utilizzata per questo tipo di diagnosi è il sequenziamento diretto degli esoni 18, 19, 20 e 21, che però mostra una sensibilità del 10% circa. La principale criticità di questa metodica diagnostica è l’assenza di materiale istologico e la sempre maggiore presenza di preparati citologici, dai quali non sempre è possibile ottenere quantità di DNA sufficienti e ben conservate per effettuare il sequenziamento diretto. Nel corso del 2011 abbiamo analizzato 108 preparati citologici in archivio presso il reparto di Anatomia Patologica dell’Ospedale Maggiore di Novara e l’Istituto Cantonale di Patologia di Locarno, ottenuti da agoaspirato (n=80 – 74,1%), liquido pleurico o ascitico (n=13 – 12,5%), lavaggio bronchiale (n=13 – 12,5%) e brushing bronchiale (n=2 – 1,9%). Il DNA è stato estratto utilizzando il kit MagneSil® Genomic Fixed Tissue System (Promega) e l’analisi mutazionale è stata condotta mediante il kit commerciale TheraScreen® EGFR29 Kit (Qiagen), che mostra una sensibilità dell’1%. La percentuale di cellule tumorali presenti nei campioni è stata classificata come <20, 20-49, 50-99, 100-199, 200-499, 500-999, >1000 cellule. Novantadue campioni sono stati amplificati (85,2%) mentre in 16 casi non è stato possibile valutare l’amplificazione (14,8%). Mutazioni di EGFR sono state riscontrate in 22 campioni (23,9%), di cui 9 mostravano una cellularità inferiore a 200 cellule e 4 con meno del 50% di cellule tumorali. I risultati ottenuti mostrano che i preparati citologici possono essere utilizzati nella diagnostica per la ricerca di mutazioni di EGFR, a condizione di utilizzare una tecnica molecolare a sensibilità elevata.
 
Obiettivi della ricerca 3) Valutazione dello stato mutazionale di KRAS in tumori colorettali e relative metastasi
Risultati ottenuti 3) Il tumore del colon-retto è una delle principali cause di morte nei paesi occidentali e la terapia di prima linea è basata su farmaci molecolari quali il Cetuximab e il Panitumumab diretti contro il dominio extracellulare di EGFR. La risposta alla terapia è determinata dalla presenza di mutazioni nel gene codificante KRAS, proteina coinvolta nella trasduzione del segnale a valle di EGFR. Nella routine diagnostica la ricerca di mutazioni avviene prevalentemente su tessuto di tumore primitivo, tuttavia è frequente la presenza di metastasi viscerali o linfonodali. Alcuni autori sostengono che mutazioni in KRAS possano avere un ruolo nello sviluppo metastatico del tumore, suggerendo di ricercare mutazioni anche nella metastasi qualora il tessuto primitivo risultasse wild type, poiché potrebbe esserci discordanza. Altri autori invece sostengono che ci sia una quasi completa concordanza tra i due tessuti. Al fine di fornire un supporto al dibattito in corso, abbiamo analizzato 40 pazienti affetti da tumore del colon-retto con relative metastasi, ricercando le mutazioni negli esoni 12 e 13 di KRAS con il kit commerciale TheraScreen®: K-RAS mutation kit (Qiagen), che mostra una sensibilità dell’1% . Sette metastasi provenivano da linfonodi (17,5%), mentre le restanti 33 erano viscerali, in particolare: fegato (22/40 - 55%), polmone (7/40 - 17.5%), ovaio (1/40 - 2.5%), cervello (1/40 - 2.5%), vagina (1/40 - 2.5%) e omento (1/40 - 2.5%). L’analisi mutazionale ha mostrato mutazioni in 15 di 40 (37,5%) campioni di tumore primitivo e relative metastasi, evidenziando una concordanza del 100%. I risultati del nostro studio mostrano che l’indagine molecolare per la ricerca di mutazioni in KRAS può essere condotta indistintamente sia su tumore primitivo che sul sito metastatico. La discordanza di risultati ottenuti in letteratura può essere ricondotta all’utilizzo di metodiche meno sensibili.
 
Obiettivi della ricerca 4) Identificazione dei riarrangiamenti PAX8/PPARgamma e mutazioni BRAF nella diagnosi citologica preoperatoria di noduli tiroidei.
Risultati ottenuti 4) La citologia agospirativa dei noduli tiroidei è una metodica di bassa sensibilità (<40%) ed elevata specificità, quest`ultima solo per quanto riguarda le neoplasie papillari, mentre per le neoplasie follicolari tale metodica non è in grado di discriminare tra lesioni benigne (adenomi) e maligne (carcinomi). Da ciò deriva che casi con citologia indeterminata, ma sospetta di lesione follicolare, vengano sottoposti a tiroidectomia totale, spesso (fino all`80%) per lesioni benigne. Da qui la necessità di implementare la sensibilità della citologia agoaspirativa per selezionare pazienti eleggibili a terapia chirurgica, mediante l`utilizzo combinato di metodiche molecolari. E` noto che mutazioni di BRAF sono presenti nel 40-70% dei carcinomi follicolari e solo raramente nelle lesioni tiroidee benigne, mentre riarrangiamenti di PAX8/PPARgamma sono riportati nel 35%-40% dei carcinomi follicolari e solo nel 2-10% degli adenomi. Su questa base abbiamo messo a punto metodiche molecolari di estrazione di DNA e rispettivamente di mRNA su materiale citologico per la ricerca delle suddette mutazioni confrontando i risultati dell`indagine molecolare e citologica con quelli istologici sul pezzo operatorio di tiroidectomia totale. Nel 2011 lo stato mutazionale di BRAF è stato valutato in 29 agoaspirati tiroidei con citologia sospetta per neoplasia maligna successivamente sottoposti a tiroidectomia totale. 12 casi hanno evidenziato mutatione BRAFV600E e 17 casi erano wild-type. Tutti i casi mutati sono stati confermati come carcinomi papillari all’esame istologico, mentre dei 17 BRAF wild-type, 12 erano carcinomi papillari (in prevalenza variante follicolare) uno adenoma follicolare ed un gozzo. (3 casi sono stati persi in follow-up) (Sensibilità 85%, specificità 100%, Valore predittivo negativo 86%, Valore predittivo positivo 100%).
L’analisi PAX8/PPARgamma è attualmente in corso.
 
Obiettivi della ricerca 5) Analisi costo-efficacia della metodica FISH applicata alla diagnostica citologica delle neoplasie pancreatico-biliari
Risultati ottenuti 5) Nella precedente ricerca pubblicata nel 2011 (Boldorini et al, Pathology) abbiamo dimostrato che l`applicazione della metodica FISH -mediante utilizzo di sonde multiprobes centromeriche e loco-specifiche- alla citologia di brushing delle vie biliari -effettuata di routine- incrementa la sensibilità e specificità diagnostica in modo significativo e soprattutto è in grado di ridurre il numero di risultati citologicamente sospetti o indeterminati. Nella fase successiva, sulla scorta dei risultati precedenti, abbiamo applicato la metodica FISH ai soli casi citologicamente sospetti o negativi, calcolando i costi dell`analisi FISH (in termini reali e di rimborso del SSN) da sola e associata alla citologia tradizionale, comparandoli con i costi delle indagini diagnostiche radiologiche necessarie nei casi sospetti o indeterminati/pro paziente, anch`essi in termini reali e di rimborso SSN. I risultati di tale studio, che dimostrano efficacia economica dell`approccio fish quale strumento diagnostico ancillare, sono in corso di pubblicazione. 
Collaborazioni in atto Dott. Milo Frattini
Laboratorio di Diagnostica Molecolare
Istituto Cantonale di Patologia
Locarno - Svizzera
Prof. Raphael Viscidi
Molecular Microbiology and Immunology Department
The Johns Hopkins Hospital
Baltimore, Maryland - USA 
Comunicazioni a congressi CONGRESSO NAZIONALE SIAPEC-IAP

Presentazione Poster: FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDISATION IN THE CYTOLOGICAL DIAGNOSIS OF PANCREATOBILIARY TUMOURS. Paganotti A, Allegrini S, Miglio U, Veggiani C, Sartori M, Antona J, Mezzapelle R, Boldorini R.

Comunicazione orale: EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR GENE ANALYSIS FROM CYTOLOGICAL SAMPLES OF LUNG ADENOCARCINOMA BY MEANS OF HIGHLY SENSITIVE MOLECULAR ASSAY. Allegrini S, Antona J, Mezzapelle R, Miglio U, Paganotti A, Veggiani C, Alabiso O,Frattini M, Monga G, Boldorini R.

 
Pubblicazioni
Serological evidence of vertical transmission of JC and BK polyomaviruses in humans.
Fluorescence in situ hybridisation in the cytological diagnosis of pancreatobiliary tumours.
Thyroid incidentaloma identified by ¹⁸F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography with CT (FDG-PET/CT): clinical and pathological relevance.
Increased detection sensitivity for KRAS mutations enhances the prediction of anti-EGFR monoclonal antibody resistance in metastatic colorectal cancer
Reciprocal potentiation of the antitumoral activities of FK866, an inhibitor of nicotinamide phosphoribosyltransferase, and etoposide or cisplatin in neuroblastoma cells
A case-control histological study on the effects of phlebotomy in patients with chronic hepatitis C.
Epidermal growth factor receptor overexpression in malignant pleural mesothelioma: prognostic correlations.