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Responsabile Maria Prat
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Antonia Follenzi   
Personale non-docente Stefano Pietronave  Andrea Zamperone   Maria Feola  Francesca Oltolina   Silvia Antonini  Riccardo Siligo  Maria Antonietta Coppola   
Obiettivi della ricerca 1) Produzione di foglietti contenenti cellule progenitrici cardiache (CPC) per ingegneria tessutale
Risultati ottenuti 1) Il cuore umano contiene una popolazione di cellule progenitrici multipotenti, isolabili mediante cromatografia di affinità con anticorpi diretti contro Sca-1 (Stem Cell Antigen-1), che sono in grado di differenziarsi in cardiomiociti in vitro e quindi rappresentano la riserva per l’omeostasi del miocardio. Purtroppo queste cellule sopravvivono solo in numero molto limitato (< 1-2%), quando vengono somministrate come sospensione di cellule isolate. Abbiamo quindi prodotto dei foglietti di celule, coltivando le cellule prelevate da pazienti sottoposti a trattamento cardiochirurgico (che avevano dato consenso informato) e le abbiamo coltivate su superficie termo-responsive, che ne hanno permesso la proliferazione a 37°C e dalla quale sono state staccate come foglietto integro abbassando la temperatura a 20°C, una volta raggiunta la confluenza. Le cellule nel foglietto continuano a mantenere caratteristiche di staminalità (caratterizzazione immunofenotipica). Il foglietto stesso è stato trapiantato sul pericardio viscerale di topi immunoincompetenti e si è visto alcune CPC migravano nel miocardio del recipiente e cominciavano a differenziarsi, acquisendo marcatori cardiaci, quali alfa actinina sarcomerica, o integrandosi nella parete endoteliale. (ricerca svolta in collaborazione con il Dr. Di Nardo, Laboratorio di Cardiologia Molecolare e Cellulare, Università Tor Vergata di Roma e la Divisione di Cardiochirurgia, Universita` degli Studi di Torino). (Forte et al., Stem Cells. 2011 Dec;29(12):2051-61). 
Obiettivi della ricerca 2) Cooperazione di segnali biologici e meccanici per il differenziamento di cellule staminali al fenotipo cardiomiocitico
Risultati ottenuti 2) É ormai accettato che le cellule non solo risentono di segnali biologici rilasciati da tessuti più lontani, matrice extracellulare e cellule vicine, ma possono essere sensibili anche a segnali fisici e meccanici, quali rigidità, rugosità di superficie, porosità, micro- e nano-architettura, del substrato su cui crescono e si differenziano. Per questo si è coniato il termine IBAS (inherently bioactive scaffolds). Abbiamo potuto dimostrare che scaffolds in PLA (acido polilattico) costituiti da 3 strati con uno spessore di 30-50 micrometri e con porosità con pori quadrati di circa 50-100 micrometri, che riproducono caratteristiche fisiche della struttura del miocardio, sono il substrato migliore per far crescere cellule staminali mesenchimali di topo, che possono acquisire l’espressione di marcatori precoci (GATA-4) del differenziamento cardiaco. Se a queste colture si aggiungono cardiomiociti neonatali purificati di topo, le cellule staminali si differenziano in modo decisamente più evidente verso il fenotipo cardiomiocitico, come rilevabile dall’espressione di marcatori precoci (ad esempio GATA-4) che viene iperespresso e tardivi (Troponina I e alfa-actinina con bandeggiatura tipica del sarcomero), che vengono acquisiti de novo. Si dimostra così che stimoli fisico-chimici e biologici possono essere combinati in vitro per riprodurre una nicchia artificiale in grado di dirigere efficacemente progenitori cardiaci verso il differenziamento. (ricerca effettuata in collaborazione con il Laboratorio di Cardiologia Molecolare e Cellulare, Università di Tor Vergata, Roma) (Pagliari et al., Cooperation of Biological and Mechanical Signals in Cardiac Progenitor Cell Differentiation. Adv Mater. 2011 Jan 25;23(4):514-8).  
Obiettivi della ricerca 3) Ruolo del microambiente nel differenziamento di cellule staminali adulte da tessuto adiposo (ADSC) verso fenotipi diversi
Risultati ottenuti 3) Il tessuto adiposo contiene una riserva di cellule indifferenziate con alto potenziale differenziativo (ASC = Adipose Stem Cells). Noi le abbiamo isolate a partire da tessuto adiposo murino della regione inguinale, e dal tessuto adiposo sottocutaneo umano (ottenuto il consenso informato), con metodiche classiche. Le cellule sono state caratterizzate per l`immnofenotipo, la multipotenzialità e la capacità proliferativa. Abbiamo stabilizzato una linea dal tessuto adiposo di topo che mantiene le caratteristiche originali testate, ed è arrivata oltre il passaggio 120 (oltre due anni in coltura), per la quale abbiamo chiesto il brevetto. La linea è stata utilizzata come modello per indurre il differenziamento verso il fenotipo cardiomiocitico a seguito di stimolazione elettrica in un bioreattore messo a punto dal Politecnico di Milano. Abbiamo trovato che solo la corrente bifasica, e non quella monofasica, all`ampiezza di 8 Volts è in grado di indurre l`espressione di Connexin 43 nei punti di contatto cellula-callula. é probabile che la combinazione di stimoli di altro tipo (ad esempio chimico, quali fattori di crescita e differenziativi) possano portare ad un fenotipo più differenziato. Inoltre si prevede di utlizzare come cellule progenitori cardiaci ottenuti, dopo consenso informato) da paziente sottoposti a cardiochirurgia. (Prat et al. (2011). Adipose Derived Stem Cells as Source for Tissue Repair and Regeneration. In: Adult Stem Cell Standardization. p. 191-208, River Publishers).  
Obiettivi della ricerca 4) Analisi del ruolo di DGK nelle proprietà biologiche delle cellule del Sarcoma di Kaposi e della possibilità di interferire per ridurne le caratteristiche di malignità
Risultati ottenuti 4) In una linea immortalizzata di Sarcoma di Kaposi (KS), in cui il recettore Met media risposte biologiche HGF-dipendenti (proliferazione, motilità, invasività) avevamo dimostrato che è possibile correlare le diverse risposte biologiche al livello di attivazione di vie di traduzione specifiche, quali MAPK e AKT. Abbiamo ora dimostrato il ruolo della diacilglicerolo chinasi (DGK) in questi fenomeni (chemotassi, proliferazione in colture convenzionali e in condizioni ancoraggio-indipendenti), utilizzando degli inibitori farmacologici o siRNA specifici per le diverse isoforme di DGK. Abbiamo visto che gli inibitori riducono notevolmente la motilità, la proliferazione e la crescita ancoraggio-indipendente delle cellule KS, mentre hanno scarso effetto inibitorio sull’adesione e o spreading delle cellule. Gli esperimenti con i siRNA hanno dimostrato che DGK-delta è principalmente coinvolto nella motilità cellulare, mentre DGK-iota è più implicato nella crescita ancoraggio-indipendente. Si dimostra così che l’inibizione di DGK è sufficiente per ridurre in vitro la proliferazione e la motilità delle cellule KS. SI suggerisce quindi che DGK possa rappresentare un nuovo bersaglio farmacologico per interferire con le proprietà maligne del KS, indipendentemente dalle vie MAPK e AKT. (ricerca svolta in collaborazione con il Prof. Graziani). (Baldanzi et al., Cancer Sci. 2011 Jul;102(7):1329-36). 
Obiettivi della ricerca 5) Nanoparticelle multifunzionali biomimetiche per la terapia dei carcinomi
Risultati ottenuti 5) Una delle applicazioni più promettenti della nanomedicina è nel campo del “gene e drug delivery”, che prevede la sintesi di nanoparticelle (NP) e la loro successiva funzionalizzazione con farmaci ad azione anti-tumorale/anti-mestatica e con anticorpi che li indirizzino in modo specifico sul tumore da questi riconosciuto. I vantaggi di questa strategia sono molteplici: le nanoparticelle per le loro caratteristiche fisiche (dimensioni nanometriche) rimangono nel circolo sanguigno per periodi prolungati prima di essere eliminate, possono attraversare la parete endoteliale dei vasi, che nei tumori è più permeabile (effetto di permeabilità e ritenzione), possono veicolare agenti terapeutici poco solubili e proteggerli da una prematura degradazione; gli anticorpi fanno “targeting” specifico e quindi si potrà usare una minore quantità di farmaco e si ridurranno gli effetti secondari di tossicità aspecifica sistemica. In quest’ottica abbiamo cominciato a produrre NP di idrossiapatite (materiale inorganico completamente biocompatibile e riassorbibile), che sono state funzionalizzate con un chemioterapico (doxorubicina) e anticorpi monoclonali diretti contro Met/recettore per l’HGF, che, essendo iperespresso in diversi tipi di carcinoma umano può agire da bersaglio contro cui le NP si direzionano. Le NP sono state caratterizzate dal punto di vista chimico-fisico e, quelle funzionalizzate, dal punto di vista dell’efficienza nel riconoscere l’antigene Met in estratti cellulari. Inoltre sono stati cominciati studi di internalizzazione (vista al microscopio confocale) e di tossicità sulle cellule (saggio MTT). (progetto in collaborazione con l`Università di Granada, Spagna). (Gómez-Morales et al., Crystal Growth & Design, ISSN: 1528-7483, doi: 10.1021/cg2004547; Iafisco et al., Dalton Trans. 2011 Jan 28; 40(4):820-7; Iafisco M, Varoni E, Di Foggia M, Pietronave S, Fini M, Roveri N, Rimondini L, Prat M. Conjugation of hydroxyapatite nanocrystals with human immunoglobulin G for nanomedical applications. Colloids Surf B Biointerfaces. 2012 Feb 1;90:1-7). 
Collaborazioni in atto - Azioni Integrate Italia Spagna: titolo del progetto di ricerca: Multifunctional drug-loaded antibody-targeted inorganic nanoparticles for biomedical use (coordinatore spagnolo Jaime Gómez Morales, Laboratorio de Estudios Cristalográficos, Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra, Granada, Spagna)
- Prof. T. Okano, Institute of Advanced Biomedical Engineering and Science, Tokyo Women`s Medical University, TWIns 8-1 Kawada-cho, Shinjuku-ku, JAPAN 
Comunicazioni a congressi - Marco Arlorio, Jean Daniel Coïsson, Fabiano Travaglia, Monica Locatelli, Matteo Bordiga, Andrea Zamperone, Stefano Pietronave, Sandra Brunelleschi, Maria Prat Radical scavenging capacity of cocoa polyphenols triggers anti-inflammatory properties in human monocytes and allows protective effects on H9c2 cardiomyoblast exposed to oxidative stress
Eurofood Chem 2011

- Andrea Zamperone, Stefano Pietronave, Jean Daniel Coïsson, Fabiano Travaglia, Monica Locatelli, Aldo Martelli, Marco Arlorio, Maria Prat
Anti-apoptotic effects of phenolic extracts from Theobroma cacao l., clovamide and epichatechin on rat cardiomyoblasts undergoing oxydative stress
Congresso Nazionale Associazione Biologia Cellulare Differenziamento (ABCD), Ravenna, 8-10 settembre 2011

- Marco Arlorio, Stefano Pietronave, Jean Daniel Coïsson, Fabiano Travaglia, Monica Locatelli, Andrea Zamperone, Aldo Martelli, Maria Prat
Phenolic extracts from Theobroma cacao l., clovamide and epichatechin display anti-radical and anti-apoptotic activities on H9c2 rat cardiomyoblasts undergoing oxidative stress. CACAO, Novara

- E. Varoni , M. Iafisco, L.Rimondini and M Prat
DEVELOPING A TARGETED DRUG DELIVERY SYSTEM: monoclonal antibodies absorption onto bonelike hydroxyapatite nanocrystals surface
Thermec, CANADA

- Michele Iafisco, Francesco Pedota, Ismaela Foltran, Maria Prat, Norberto Roveri
Preparation of poly(l-lactic acid)-hydroxyapatite microspheres for bone tissue engineering applications.
Training school "Synthesis of hybrid organic-inorganic nanoparticles for innovative nanostructured composites” Napoli, 28 February - 2 March 2011

- José Manuel Delgado-López, Michele Iafisco, Isaac Rodríguez-Ruiz, Elena Varoni, Maria Prat, Lia Rimondini, Jaime Gómez-Morales
Biomimetic carbonate-apatite nanoparticles functionalized with doxorubicin for applications in nanomedicine
XXII Congress and General Assembly of the International Union of Crystallography, Madrid, 22-30 August 2011

- Michele Iafisco, Elena Varoni, Jaime Gòmez-Morales, Josè Manuel Delgado-Lòpez, Norberto Roveri, Lia Rimondini and Maria Prat
Cell surface receptor targeted nanocrystalline apatites for cancer therapy
24th European Conference on Biomaterials, Dublin. Sept 2011

- Elena Varoni, Michele Iafisco, Jaime Gòmez-Morales, Josè Manuel Delgado-Lòpez, Norberto Roveri, Lia Rimondini and Maria Prat
Cell surface receptor targeted hydroxyapatite nanoparticles for cancer therapy
53rd Annual Meeting of the Italian Cancer Society - Torino, 19-22 October 2011

- Pietronave S, Zamperone A, Oltolina F, Cochis A, Carletta A, Altomare L, Faré S, Novelli E, Diena M, Rimondini L, Prat M.
THERMO-RESPONSIVE METHYLCELLULOSE HYDRO-GEL FOR ENGINEERED HUMAN CARDIAC PROGENITOR CELL (hCPCs) SHEETS.
XVIII Congresso Nazionale della Società Italiana di Ricerche Cardiovascolari, Imola, ottobre 2010

- Zamperone A, Pietronave S, Cochis A, Carletta A Altomare L, Faré S, Novelli E, Diena M, Rimondini L, Prat M.
SMART METHYLCELLULOSE HYDRO-GEL FOR ENGINEERED HUMAN CARDIAC PROGENITOR CELL (hCPCs) SHEETS.
World Conference on Regenerative Medicine; Leipzig, Germany, Nov.2011



 
Pubblicazioni
Human cardiac progenitor cell grafts as unrestricted source of supernumerary cardiac cells in healthy murine hearts.
Diacylglycerol kinases are essential for hepatocyte growth factor-dependent proliferation and motility of Kaposi`s sarcoma cells.
Pharmacological postconditioning protects against hepatic ischemia/reperfusion injury.
Cooperation of biological and mechanical signals in cardiac progenitor cell differentiation
Adsorption and spectroscopic characterization of lactoferrin on hydroxyapatite nanocrystals.
Adipose Derived Stem Cells as Source for Tissue Repair and Regeneration.
Stem Cell Delivery into the Myocardial Wall