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Responsabile Mara Giordano
Settore di ricerca Genetica Medica
Personale docente    
Personale non-docente Michela Godi  Ileana Fusco  Simona Mellone  Laura Cislaghi            
Obiettivi della ricerca 1) IDENTIFICAZIONE DI VARIANTI FUNZIONALI NELL’INTRONE 1 DEL GENE PROP-1 ASSOCIATI AL DEFICIT COMBINATO DI ORMONE DELLA CRESCITA (CPHD).
Risultati ottenuti 1) In una regione conservata nell’IVS1 del gene PROP-1 avevamo identificato 4 SNPs, tre dei quali già noti (rs73346254, c.109+435G>A; rs4498267, c.110+463; rs4431364, c110-719) e una nuova delezione di 3 bp (c.110-572_-570delTAG). Era stato eseguito uno studio caso-controllo su 107 pazienti affetti da CPHD e 295 controlli che mostrava un’associazione significativa per rs73346254 A (p=0,0003; OR=3,47) e IVS1c.110-572_-570 delTAG (p=0,004 OR=2,60 e per l’aplotipo
A-delTAG (p=0,0002; OR=3.77). Le due variazioni sono in linkare disequilibrium (D’=0,81 e r2= 0,64).
L’influenza degli SNPs sulla trascrizione è stata valutata mediante saggi di luciferasi, con costrutti contenenti gli aplotipi con le 4 combinazioni dei 2 SNPs posti a monte di un promotore minimo TK. La trasfezione in cellule MCF7 e GH4C1 ha mostrato una diminuizione altamente significativa dell’attività trascrizionale dell’aplotipo A-delTAG rispetto all’aplotipo di riferimento (G-TAG) in entrambi i tipi cellulari (p<10-3 e p<10-6, rispettivamente).
Al fine di valutare se gli alleli dei due SNPs legassero con diversa affinità dei fattori trascrizionali sono stati condotti saggi EMSA su estratti nucleari di MCF7 e GH4C1. La sonda corrispondente alla sequenza che circonda il polimorfismo c.110-572_-570TAG/delTAG ha mostrato un forte legame con un fattore nucleare solo in presenza dell’allele TAG. La sonda intorno all’ rs73346254 non ha evidenziato alcun legame per entrambi gli alleli.
In presenza dell’aplotipo A-delTAG, associato a CPHD, la trascrizione non viene dunque attivata in maniera efficiente. L’influenza negativa esercitata sulla trascrizione è verosimilmente mediata da un’interazione tra i due alleli ai due SNPs, che modifica il legame con un fattore trascrizionale. L’EMSA dimostra che tale fattore si lega solo all’allele TAG in corrispondenza della posizione c.110-572_-570 e non all’allele delTAG. Probabilmente esiste una cooperazione tra questo fattore e la sequenza che circonda lo SNP rs73346254, non rilevabile con l’EMSA.
In conclusione il nostro lavoro ha permesso di identificare per la prima volta delle varianti associate a CPHD con un significato funzionale, che avvalorano l’ipotesi di un’eziologia multifattoriale per questa patologia.
 
Obiettivi della ricerca 2)
RICERCA DI MUTAZIONI NEL GENE HNF1B IN PAZIENTI ADULTI CON CISTI RENALI E MALFORMAZIONI RENALI ED EXTRARENALI
Risultati ottenuti 2)  Studi condotti su pazienti in età prenatale e pediatrica con fenotipo renale ben definito (ipercogenicità all’ecografia e cisti bilaterali) hanno permesso di stimare una frequenza di mutazioni nel gene HNF1β compresa tra 10-20%. Poche sono le informazioni sulla frequenza di mutazioni in pazienti in età adulta.
Nell’adulto alterazioni di HNF1β causano una serie eterogenea di patologie autosomiche dominanti caratterizzate da anomalie congenite del rene e del tratto urinario, malformazioni genitali e MODY5. Abbiamo avviato in collaborazione con l’Unità di Nefrologia e Trapianto Renale di Novara uno studio su adulti affetti da cisti renali e malformazioni renali ed extra-renali di varia origine.
Sono stati sino ad ora analizzati circa 48 pazienti, di cui 23 casi familiari, per la presenza di mutazioni puntifomi e delezioni del gene HNF1β.
Il sequenziamento ha permesso di identificare 2 mutazioni nella regione codificante. La prima, c.384_delCATGCAG, è stata individuata in un caso familiare con cisti bilaterali e diabete. La mutazione, insorta de novo nella probanda e trasmessa alle due figlie affette, determina un frameshift e la produzione di una proteina tronca. La seconda, Ala314Thr, in un caso sporadico con insufficienza renale cronica e cisti renali, cade in un sito altamente conservato nelle specie e non è stata identificata in 200 controlli sani. Non sono tuttavia disponibili i genitori per valutare se si tratta di una nuova mutazione.
L’analisi con MLPA degli esoni di HNF1β ha evidenziato in due pazienti con famigliarità per patologie renali la presenza di una delezione dell’intero gene HNF1B. In una di queste pazienti era presente oltre ad ipoplasia renale ediabete, la sindrome di Mayer-Rokitansky-Kuster-Hauser (malformazioni genito-urinarie). Per meglio definire l’estensione della delezione è stata eseguita un’analisi mediante CGH-array che ha individuato una regione deleta di circa 1,8 Mb (chr17:31461588-33322972) in 17q12 comprendente il gene HNF1β.
In conclusione lo screening del gene HNF1β in pazienti con patologie renali cistiche di varia entità associate anche ad altre malformazioni ha permesso di identificare mutazioni nell’8,3 % dei pazienti totali (13% dei casi familiari e 5% dei casi sporadici) sottolineando l’importanza dello screening di questo gene anche nei pazienti adulti con fenotipo eterogeneo.
 
Obiettivi della ricerca 3) RICERCA DI MUTAZIONI NELLA REGIONE CODIFICANTE E NELL’ENHANCER DEL GENE SHOX IN PAZIENTI CON BASSA STATURA IDIOPATICA (ISS) NELLA POPOLAZIONE PIEMONTESE.
Risultati ottenuti 3) Mutazioni puntiformi e delezioni nel gene SHOX (Short Stature Homeobox-containing gene), localizzato nella regione PAR1 (Xp22.33 e Yp11.3) rappresentano una delle rare cause genetiche note di Bassa Statura Idiopatica (ISS, Idiopathic Short Stature). Recentemente è stata inoltre identificata una regione di 250 kb a valle del gene nella quale sono state trovate delezioni in pazienti ISS.
Questo studio si colloca nell’ambito di una ricerca più ampia volta a caratterizzare le basi genetiche dei difetti della crescita, mediante l’analisi di geni candidati e l’identificazione di nuovi geni. Abbiamo sino ad ora analizzato per SHOX, 50 pazienti affetti da ISS, (altezza≤ -2 SDS) mediante sequenziamento e analisi MLPA (per la ricerca di delezioni/duplicazioni).
Lo screening della regione codificante ha permesso di identificare due sostituzioni nucleotidiche non-sinonime: c.174C>A (nell’esone 2) che causa la variazione aminoacidica Asp58Glu, mai descritta in precedenza e c.676T>C (nell’esone 6B), a livello di uno dei due codoni di stop alternativi (Stop226Arg) che determina la formazione di una proteina più lunga di 22 aminoacidi, già descritta in letteratura. Stiamo valutando se si tratta di mutazioni de novo.
L’analisi mediante MLPA ha evidenziato una delezione compresa tra 10kb e 70 kb all’estremità 5’ dell’enhancer. La maggior parte delle delezioni sino ad oggi riportate nell’ISS coinvolgono regioni molto più ampie (comprese tra 200 kb e 1 Mb). La caratterizzazione dei punti di rottura di questa delezione contribuirà ad una migliore definizione delle regioni minime dell’enhancer coinvolte nella regolazione trascrizionale di SHOX. La delezione è stata confermata utilizzando i marcatori microsatelliti DXYS10096 e DXYS10087 e rappresenta una mutazione de novo, dato che i genitori di statura normale sono risultati negativi per la stessa.
In conclusione in questa prima fase di uno studio sulle cause genetiche di ISS in una casistica che afferisce alla Clinica Pediatrica dell’AOU dell’Ospedale di Novara abbiamo identificato mutazioni in SHOX nel 6% dei pazienti, in accordo con i dati sino ad ora riportati in letteratura.
  
Collaborazioni in atto  
Comunicazioni a congressi IDENTIFICAZIONE DI VARIANTI FUNZIONALI NELL’IVS1 DEL GENE PROP-1 (PROPHET OF PIT-1) ASSOCIATI AL DEFICIT COMBINATO DI ORMONE DELLA CRESCITA (CPHD). M. Godi, S. Mellone, F. Ferrante, L. Tiradani, R. Marabese, G. Bona, M. Giordano. XIV Congresso nazionale SIGU (Società Italiana di Genetica Umana); 13- 16 novembre 2011 Milano

RICERCA DI MUTAZIONI NELLA REGIONE CODIFICANTE E NELL’ENHANCER DEL GENE SHOX IN PAZIENTI CON BASSA STATURA IDIOPATICA (ISS) NELLA POPOLAZIONE PIEMONTESE. Francesca Ferrante, Antonella Petri, Giulia Genoni, Flavia Prodam, Simonetta Bellone, Michela Godi, Simona Mellone,Gianni Bona e Mara Giordano. XIV Congresso nazionale SIGU (Società Italiana di Genetica Umana); 13- 16 novembre 2011 Milano


RICERCA DI MUTAZIONI NEL GENE HNF1B (Hepatocyte nuclear factor 1β) IN PAZIENTI ADULTI CON CISTI RENALI E/O MALFORMAZIONI RENALI ED EXTRARENALI. Simona Mellone, Caterina Canavese, Alice Monzani, Agata Bizzocchi, Michela Godi, Lucia Corrado, Francesca Ferrante, Chiara Ghimenti, Paola Ostano, Giovanna Chiorino, Piero Stratta, Mara Giordano. XIV Congresso nazionale SIGU (Società Italiana di Genetica Umana); 13- 16 novembre 2011 Milano
 
Pubblicazioni
A novel HESX1 splice mutation causes isolated GH deficiency by interfering with mRNA processing.