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Responsabile Roberta Rolla
Settore di ricerca Patologia Clinica
Personale docente Giorgio Bellomo  Patrizia Zeppegno  Oscar Alabiso
Personale non-docente Vidali Matteo  Patrizia Pergolini  Laura Forti               
Obiettivi della ricerca 1) Venlafaxina e CYP2D6 nella pratica clinica: uno studio pilota.
Risultati ottenuti 1) La venlafaxina (V) è un SNRI, metabolizzato principalmente dal citocromo CYP450 2D6 in O-desmethylvenlafaxine (ODV), il principale metabolita attivo.
L`efficacia del test farmacogenetico è controverso, perché l`associazione tra livelli plasmatici di V/ODV e gli effetti collaterali non è attestata. Per tali ragioni è in corso uno studio pilota, che ha ottenuto l'assenso dal Comitato Etico dell'azienda Ospedaliera-Universitaria Maggiore della carità di Novara, che prevede l'arruolamento di pazienti di razza caucasica, in età adulta (18-65 anni) ed appartenenti ad entrambi i sessi, con diagnosi di Depressione Maggiore, Disturbo Bipolare – Episodio Depressivo, Distimia o Reazione depressiva, in terapia, attuale o pregressa, con Venlafaxina (Efexor, capsule a rilascio prolungato) ad un dosaggio compreso tra 75 e 300 mg/die.
I dati attualmente disponibili non sono ancora sufficienti per poter verificare se esista un`associazione significativa tra dose efficace raggiunta (75 mg/die; 150 mg/die; 225 mg/die; 300 mg/die), comparsa di effetti collaterali e/o cambio terapia, entrambe considerate come variabili dicotomiche, e genotipo.  
Obiettivi della ricerca 2) Associazione tra polimorfismi del CYP2D6 e risposta clinica in donne con tumore della mammella trattate con tamoxifen: uno studio pilota.
Risultati ottenuti 2) Il Tamoxifen costituisce da 25 anni la terapia endocrina di riferimento nel trattamento dei tumori della mammella che esprimono il recettore degli estrogeni. L'azione inibitoria sulla proliferazione è in realtà mediata dai metaboliti del tamoxifen, 4-idrossitamoxifen e endoxifen, prodotti dall'azione del CYP2D6. Sono stati individuati quattro fenotipi per il CYP2D6: i poveri metabolizzatori (PM), i metabolizzatori intermedi (IM), gli estesi (EM) e gli ultrarapidi (UM). E' stato ipotizzato che la concentrazione dei metaboliti attivi sia correlata con l'assetto genotipico delle pazienti, con importanti influenze sulla risposta terapeutica, come peraltro dimostrato da alcuni studi condotti in Europa e Asia. Lo studio in corso si propone di stabilire se variazioni genetiche nel CYP2D6 possano condizionare non solo la risposta terapeutica al Tamoxifen, ma anche la comparsa di effetti collaterali.
Lo studio pilota in corso, che ha ottenuto l'assenso dal Comitato Etico dell'azienda Ospedaliera-Universitaria Maggiore della carità di Novara, prevede l'arruolamento di donne in corso di terapia adiuvante con tamoxifen per l'analisi dei polimorfismi del CYP450-2D6, la valutazione dell'associazione tra varianti genetiche del CYP2D6 e risposta clinica al Tamoxifen (comparsa di effetti collaterali o recidiva) e l'analisi dei costi/benefici di un tale approccio farmacogenetico.
I criteri di inclusione consistono: nella diagnosi istologica di tumore della mammella (stadi I, II, III), nessuna chemioterapia o trattamento endocrino diverso dal Tamoxifen, nessuna metastasi al momento della diagnosi, positività immunoistochimica del tumore per la presenza del recettore degli estrogeni.
Nel gruppo preliminare di pazienti in terapia adiuvante con tamoxifen, arruolate tra marzo 2010 e settembre 2010, abbiamo potuto verificare che esiste una forte associazione (p=0.027) tra comparsa di effetti collaterali e presenza di alleli multipli funzionali *1 (*XN)(metabolizzatori rapidi o ultra metabolizzatori; UM). 
Obiettivi della ricerca 3) Ruolo del laboratorio nel monitoraggio della funzionalità piastrinica in pazienti in trattamento con aspirina.
Risultati ottenuti 3) La crescente domanda di monitoraggio terapeutico in pazienti in trattamento con aspirina è avvenuta di pari passo con lo sviluppo di una varietà di strumenti e analisi di laboratorio, la cui utilità è ancora in discussione. Mentre alcuni autori hanno riportato un`alta incidenza di resistenza all`aspirina, recenti studi hanno invece dimostrato che questo evento è in realtà raro, se la risposta al trattamento con aspirina viene monitorata con test specifici adeguati. Si è voluto investigare così il potenziale ruolo del laboratorio nel monitoraggio di routine del trattamento con aspirina.
Al momento sono stati arruolati 104 pazienti in monoterapia stabile con aspirina dopo chirurgia cardiovascolare. La funzionalità piastrinica è stata valutata con PFA100®, dotato delle cartucce collagene/epinefrina (CEPI, cut-off 165s) e collagene/ADP (CADP), e con l'analizzatore ad impedenza multidisco® utilizzando acido arachidonico (ASPItest, pos se <862 AUC) ADP (ADPtest), o collagene (COLtest, pos se <607 AUC).Finora abbiamo potuto osservare che 60 (58%) e 69 (66%) pazienti presentano, rispettivamente, un CEPI prolungato (> 165s) e un COLtest positivo (<607), ma il 100% dei pazienti ha un ASPItest inferiore a 862, suggerendo nessuna resistenza all`aspirina (mediana 178 , IQR 144-296, min-max 59-737). Una correlazione moderata è stata osservata tra COLtest e ASPItest (r di Spearman = 0,54 p <0,001) e tra CEPI e ASPItest (r =- 0,44 Spearman p <0,001). I pazienti con ASPItest <300 (75 ° percentile della distribuzione dei pazienti) hanno valori di COLtest più bassi (mediana 474, IQR 387-578 vs 714, IQR 570-870; p <0,001) e CEPI positivo (mediana 300, IQR 158-300 vs 120, IQR 98-165; p <0,001) rispetto ai pazienti con ASPItest> 300. Da questi dati preliminari è inoltre emerso che 24 pazienti con ASPItest <300 presentano valori normali di CEPI, suggerendo attività residua delle piastrine.
 
Obiettivi della ricerca 4) L`emolisi è una delle principali cause della variabilità nel dosaggio di insulina durante la Curva da Carico di Glucosio nei bambini.
Risultati ottenuti 4) Il dosaggio dei livelli plasmatici di insulina durante la Curva da Carico di Glucosio (OGTT) ha un ruolo centrale nella pratica clinica per la diagnosi di insulino-resistenza. Pertanto, una caratterizzazione completa delle possibili interferenze pre-analitiche ed analitiche risulta obbligatoria.
Lo scopo di questo studio è stato quello di caratterizzare gli effetti dell'emolisi sul dosaggio dei livelli di insulina nel siero di 35 bambini con sospetto deficit di GH, a rischio di insulino-resistenza.
Abbiamo osservato come l`interferenza negativa dell'emolisi sul dosaggio dell'insulina aumenti non solo in proporzione al grado di emolisi, ma anche proporzionalmente al tempo che intercorre tra il prelievo ematico e l'analisi dello stesso. Livelli di emolisi da 0,1 a 10 g Hb / L causano già dopo 3 minuti di incubazione a temperatura ambiente una significativa interferenze negative con il dosaggio immunometrico dell'insulina(da 5% a 80% rispettivamente. L`interferenza negativa dell`emolisi aumenta in maniera significativa dopo 30, 60, 120 min. dal prelievo venoso, aspetto molto importante se si considera il fatto che i differenti prelievi dell`OGTT vengono normalmente portati in Laboratorio tutti insieme, dopo l`ultimo prelievo a 120 minuti.
Inoltre, l`emolisi interferisce anche sulla variabilità nella misura di insulina, con una variabilità media dei livelli di insulina dosati, che aumenta dal 40% al 90%, rispettivamente nei campioni non emolizzati e emolizzati.
L`interferenza negativa dell`emolisi sul dosaggio dell`insulina è quindi cruciale, soprattutto nei bambini, dove il prelievo ematico risulta molto spesso emolizzato a causa delle modalità e difficoltà del prelievo. Attualmente tutti i campioni di sangue vengono processati per il dosaggio dell`insulina. Dai nostri dati appare obbligatorio da un lato segnalare nel referto la presenza dell`emolisi, contestualmente al valore dei livelli di insulina misurati, dall`altro processare i campioni subito dopo il prelievo ematico.
 
Obiettivi della ricerca 5) Appropriatezza delle richieste di indagine molecolare per il fattore V di Leiden.
Risultati ottenuti 5) La resistenza alla proteina C attivata (rPCA) rappresenta una delle più frequenti cause di trombofilia, dovuta nella maggior parte dei casi al polimorfismo di Leiden del gene del Fattore V (Arg506Gln). In questo studio abbiamo valutato l'appropriatezza delle richieste dell'indagine genetico-molecolare di II livello nell'ambito della diagnosi di trombofilia.
Nel periodo gen 2006 – mar 2010, il Laboratorio ha ricevuto 4969 richieste di FV Leiden a fronte di 3010 richieste di rPCA. Il polimorfismo di Leiden era presente in 372 (7.5%) soggetti in eterozigosi e in 10 (0.2%) soggetti in omozigosi, con una frequenza del tutto comparabile a quella della popolazione Italiana non selezionata. Delle 3010 richieste per rPCA, 183 (6.1%) sono risultate positive (ratio<0,7) e 2827 (93.9%) negative (ratio>0.7). A 1468 (52%) dei 2827 soggetti negativi per rPCA, è stata comunque richiesta l'analisi genetica per Fattore V di Leiden, che è risultata negativa in tutti. Al contrario, soltanto a 106 (57.9%) dei 183 soggetti risultati positivi per rPCA è stata richiesta l'analisi genetica, risultata positiva in tutti. Per i restanti 77 soggetti positivi per rPCA non è mai stata richiesto successivamente alcun approfondimento molecolare.
Ad un'analisi preliminare di appropriatezza prescrittiva, la richiesta dell'esame genetico-molecolare di II livello in 1468 soggetti già negativi allo screening per rPCA (I livello), ha determinato una spesa aggiuntiva di euro 38/campione (al netto della spesa reagenti senza costi aggiuntivi ore uomo) per una spesa complessiva di euro 55784 €. I dati evidenziano la necessità di interventi informativi e formativi immediati e capillari, rivolti ai Medici delle Unità Operative e del Territorio, relativamente all'appropriatezza prescrittiva per la diagnosi di trombofilia.
 
Collaborazioni in atto   
Comunicazioni a congressi P. Zeppegno, R. Rolla, V. Dalò, F. Ressico, A. Parafioriti, P. Prosperini, M. Vidali, G. Bellomo, E. Torre. Venlafaxine and CYP2D6 in clinical practice: work in progress. 18th European Congress of Psychiatry. 25-28 Febrary 2010 Munich,Germany.

M.Vidali, P. Pergolini, R. Rolla, G. Bellomo.
Role of the Laboratory in monitoring platelet function in patients with aspirin treatment.
XXI International Congress on Thrombosis. Milan, 6-9 July 2010.

Appropiatezza delle richieste di indagine molecolare per il fattore V di Leiden.
R. Rolla, S. Meola, P. Pollarolo, M. Vidali, P. Pergolini, G. Bellomo
Evento Nazionale Congiunto SIBIoC-SIMEL, Roma 5-8 ottobre 2010.
 
Pubblicazioni
Platelet-Large Cell Ratio and the extent of coronary artery disease: results from a large prospective study.
Platelet distribution width and the extent of coronary artery disease: Results from a large prospective study.
Role of 2 common variants of 5HT2A gene in medication overuse headache.
Evaluation of amoxicillin plasma and tissue levels in pediatric patients undergoing tonsillectomy.
Left atrial asynchrony is a major predictor of 1-year recurrence of atrial fibrillation after electrical cardioversion.