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Responsabile Mara Giordano
Settore di ricerca Genetica Medica
Personale docente    
Personale non-docente Michela Godi  Simona Mellone  Laura Cislaghi               
Obiettivi della ricerca 1) Analisi funzionale di polimorfismi nel primo introne del gene PROP-1 associati al deficit combinato di ormone della crescita (CPHD).
Risultati ottenuti 1) Al fine di identificare varianti polimorfiche nel gene PROP-1 (Prophet of Pit-1) associate a CPHD (deficit combinato di ormone della crescita) è stata sequenziata una regione conservata di 150 bp nel primo introne e le regioni ad essa fiancheggianti. Tale regione aveva mostrato attività di enhancer nel gene Prop-1 del topo. Sono stati identificati 4 polimorfismi, tre dei quali già noti (rs73346254, rs4498267, rs4431364) e una nuova delezione di 3bp a +915.
Lo studio di associazione eseguito su 72 pazienti CPHD e 420 controlli ha mostrato un'associazione significativa per rs73346254 e IVS1+915 (p=0.037 e p=0.002) ed in particolare per l'aplotipo rs73346254A/IVS1+915delTAG (p=0.0012).
L'influenza dei polimorfismi sull'attività trascrizionale è stata valutata mediante saggi di luciferasi, con costrutti contenenti le 4 possibili combinazioni aplotipiche generate dai 2 polimorfismi associati in orientamento sense o antisense rispetto ad un promotore minimo TK. Esperimenti di trasfezione in cellule GH4C1 e MCF7 mostravano una diminuzione altamente significativa dell'attività trascrizionale dell'aplotipo associato (rs73346254A/IVS1+915delTAG) rispetto all'aplotipo di riferimento (rs73346254G/IVS1+915TAG) in entrambe le direzioni in entrambi i tipi cellulari (p=10-3-p=10-11).
Questi risultati suggeriscono che nell'IVS1 di PROP-1 è presente anche nell'uomo un elemento con funzione di enhancer e che sono presenti due polimorfismi che contribuiscono alla suscettibilità al CPHD. 
Obiettivi della ricerca 2) Ricerca di mutazioni nel gene HNF1β in pazienti con insufficienza renale cronica a causa sconosciuta, malformazioni renali neonatali e diabete giovanile ad insorgenza tardiva.
Risultati ottenuti 2) L'obiettivo di questo progetto era la messa a punto dell'analisi mutazionale del HNF1β in pazienti con cisti renali e insufficienza renale cronica.
Sono stati reclutati dal Centro Dialisi e Trapianto Renale dell'Azienda Ospedaliera “Maggiore della Carità” di Novara sino ad ora 50 pazienti con insufficienza renale cronica con e senza famigliarità con reperto ecografico di cisti renali multiple, ipertensione arteriosa insorta in giovane età, iperuricemia e/o gotta, malformazioni renali, dialisi o trapianto renale e ad eziologia non definita.
Il DNA è stato estratto da sangue intero mediante colonnine (Qiagen). I 9 esoni della regione codificante e il promotore prossimale del gene HNF1β sono stati sequenziati su sequenziatore automatico e sono state identificate 4 mutazioni causali.
La prima è una microdelezione di 7 bp nell'esone 2 dal nucleotide c.384 a c.390 (c.384_390delCATGCAG) che causa un frameshift e la comparsa di un codone di Stop prematuro identificata in una famiglia con tre membri affetti. Le altre due sono mutazioni missense, una delle quali già identificata in un altro paziente riportato in letteratura.
Dato che in buona parte dei pazienti sono presenti grosse delezioni abbiamo messo a punto un test con 4 marcatori microsatelliti (due all'interno degli introni del gene e due al di fuori del gene ma compresi nella regione di 1.7 Mb comunemente deleta) per valutare la perdita di eterozigosi nella regione HNF1β. Una paziente con varie malformazione dell'apparato urogenitale (sospetta sindrome di Mayer-Rokitansky) è risultata omozigote per tutti e 4 i microsatelliti, indicativo di una perdita di eterozigosi. L'analisi mediante CGH array ha rivelato la presenza di una delezione di 1,8 Mb che includeva HNF1β. La delezione è stata confermata mediante la tecnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification).
In conclusione sino ad ora abbiamo identificato mutazioni nell'8% dei pazienti, in accordo con i dati riportati in letteratura. 
Obiettivi della ricerca 3) Analisi funzionale di una mutazione di splicing nel gene HESX1.
Risultati ottenuti 3) Mutations in HESX1 represent a rare cause of Growth Hormone Deficiency (GHD) associated with a broad spectrum of other anomalies. We searched for causative mutations in a cohort of 244 Italian patients affected by Combined and Isolated GDH by DHPLC scanning.
A novel mutation adjacent to the invariant donor splice site of intron 2 (c.357+3G>A) was identified at the heterozygous state in a IGHD patient. The in vitro and in vivo mRNA analysis of the wild-type HESX1 allele revealed the presence of the whole cDNA and two isoforms lacking exon 2 and exons 2-3, respectively. The mutant HESX1 allele yielded only two splicing products, the whole cDNA and the cDNA missing exons 2-3, whereas the mRNA lacking exon 2 was absent. An in vitro assay demonstrated that the exon 2 deleted mRNA, predicting a prematurely truncated protein, is subjected to nonsense-mediated mRNA decay (NMD).
We demonstrated that the c.357+3G>A mutation prevents the generation of one of the alternative isoform normally produced by the wild-type allele, predicting a truncated HESX1 protein. The mutation is likely to cause IGHD in the heterozygous patient by interfering with the downregulation of HESX1 expression mediated by alternative splicing and NMD.
Our results open new insight into the mechanism of HESX1 regulation suggesting that the coupling of alternative splicing and NMD might play a fundamental role in directing the HESX1 expression and that the alteration of this process might lead to severe consequences. 
Collaborazioni in atto   
Comunicazioni a congressi   
Pubblicazioni
Immunoproteasome LMP2 60HH variant alters MBP epitope generation and reduces the risk to develop multiple sclerosis in Italian female population.
The case of the solitary sick kidney.