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Responsabile Antonia Follenzi
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Maria Prat   
Personale non-docente Simone Merlin  Gabriella Ranaldo  Stefania Cannizzo  Sara Cristinelli  Diego Zanolini  Chantal Grosso  Mattia Salvatore  Piercarla Schinco
Obiettivi della ricerca 1) “Utilizzo di progenitori ematopoietici derivati da midollo o da sangue di cordone per la terapia cellulare dell'Emofilia A”.
Risultati ottenuti 1) In questo primo anno ci siamo concentrati sullo studio dell'espressione di FVIII nel midollo osseo umano. In collaborazione con la Clinica di Ematologia dell'Ospedale Maggiore della Carità di Novara abbiamo saggiato 21 midolli di persone sane. Sui campioni ricevuti è stato isolato l'RNA e sono state eseguite reazioni di RT-PCR. Abbiamo disegnato diverse coppie di primers specifici per il gene del FVIII che appaiano su diversi esoni in modo da ottenere degli ampliconi specifici per il nostro trascritto. La PCR è risultata positiva su quasi tutti i campioni. Su 4 campioni abbiamo poi confermato la specificità della reazione di amplificazione mediante sequenziamento nucleotidico dell'amplicone ottenuto. Sempre per RT-PCR abbiamo confermato l'espressione di FVIII nelle cellule mesenchimali derivate da midollo umano. Abbiamo inoltre verificato che le cellule CD34+ di cordone umano sono positive per il trascritto del FVIII. Adesso ci stiamo attrezzando per ottenere campioni di sangue da cordone ombelicale, per confermare la presenza del trascritto di FVIII in queste cellule e procedere al loro frazionamento e messa in coltura. Abbiamo inoltre saggiato l'RNA di 4 campioni di monociti umani ed abbiamo confermato la presenza di trascritto di FVIII anche in queste cellule ematopoietiche mature. I nostri dati sui campioni umani confermano i risultati ottenuti in precedenza sul topo circa l'espressione del FVIII nel tessuto ematopoietico. Ci stiamo organizzando per poter procedere all'analisi dell'espressione del FVIII nelle diverse popolazioni cellulari del midollo dopo frazionamento e messa in coltura, per verificare la secrezione di FVIII nel mezzo di coltura addizionato o meno di fattore di von Willebrand, che ha il compito di stabilizzare il FVIII eventualmente secreto dalle cellule. La secrezione di FVIII verrà poi saggiata mediante saggio ELISA commerciale. 
Obiettivi della ricerca 2) Terapia genica della Beta-thalassemia con iperespressione della transferrina mediante mediante l`uso dei vettori lentivirali .
Risultati ottenuti 2) In questo lavoro sono stati realizzati vettori lentivirali contenenti la transferrina umana sotto il controllo di un promotore ubiquitario (PGK) o epato-specifico (TTR), in presenza di una sequenza MirT-142-3p inserita al 3' che impedisce l'espressione della Tf in cellule ematopoietiche; tali vettori sono stati caratterizzati mediante trasduzione di linee cellulari, seguita da analisi al citofluorimetro e i saggi di espressione proteica, che hanno dimostrato la tessuto-specificità del promotore TTR e hanno confermato il buon funzionamento del promotore PGK. Purtroppo, l'espressione non ad alti livelli della Tf con i VL nei topi talassemici e normali non ci ha permesso di osservare in questo studio i risultati osservati con la somministrazione della transferrina esogena.
Abbiamo bisogno di iperesprimere la transferrina se vogliamo ottenere un effetto terapeutico paragonabile a quello della iniezione esogena di Tf ricombinante. I risultati di questo studio potrebbero chiarire come si regola il trasporto del ferro durante l`eritropoiesi.
Questi studi hanno permesso di rilevare che l'espressione a lungo termine della hTf è priva di effetti collaterali ma non possiamo dire che migliora la patologia dei topi talassemici per cui per generare dati pre-clinici validi per considerare l'applicazione clinica in pazienti affetti da berta-talassemia dobbiamo ancora ottimizzare il sistema di trasferimento genico. Non sappiamo se i bassi livelli di transferrina ottenuti sono da considerarsi un limite del vettore utilizzato o se l'espressione della Tf è controllata a livello post-trascrizionale tale da non ottenere iperespressione. Questi valori sono stati ottenuti sia nei topi talassemici che nei topi normali, anzi possiamo affermare che l'espressione di transferrina non è rilevante nei topi normali trasdotti con i diversi vettori sia dopo espressione ubiquitaria che tessuto specifica con la presenza di un MirT che impedisce l'espressione nelle cellule ematopoietiche. Mentre nei topi talassemici iniettati con il vettore ubiquitario abbiamo ottenuto espressione di transferrina che è aumentata nel tempo, i risultati ottenuti sono stati comunque inferiori ai risultati ottenuti con l'iniezione di Tf umana esogena.
In questo momento gli stessi vettori (PGK e TTR con la sequenza mirT142-3p) sono stati iniettati in dose maggiore in topi talassemici a NY e stiamo attendendo i risultati di trasduzione ed espressione prima di poter speculare sull'uso dei VL contenenti la Tf con diversi sistemi di controllo dell'espressione per la cura della talassemia. 
Obiettivi della ricerca 3) Isolamento di cellule di Kupffer dal fegato di topo, differenziamento in vivo di macrofagi da midollo osseo e trapianto in topi emofilici.
Risultati ottenuti 3) Abbiamo isolato e caratterizzato i macrofagi epatici murini ed abbiamo ottimizzato il protocollo per la generazione di macrofagi derivati da midollo osseo murino (MDMO). Questi esperimenti hanno dimostrato che la popolazione isolata erano CK e che le cellule del midollo potevano essere differenziate in macrofagi.
Abbiamo svolto esperimenti in topi singenici ed eseguito studi di biodistribuzione delle CK e dei MDMO dopo iniezione nella vena della coda o dopo iniezione intraportale ed abbiamo visto che le cellule migravano principalmente nel fegato.
Negli studi di trapianto e longevità delle CK abbiamo visto che le cellule attecchiscono nel fegato ma non proliferano e sono presenti per almeno 3 mesi (il tempo piu' lungo analizzato) mentre abbiamo osservato che i MDMO non attecchiscono nel fegato e che dopo 48 ore non sono più rintracciabili nel topo.
Infine abbiamo eseguito studi funzionali sulle CK che hanno dimostrato l'integrità in vivo delle cellule trapiantate.
Trapianto di CK sane in topi emofilici.
Dopo aver verificato che le CK esprimevano FVIII abbiamo isolato CK dal fegato di topi sani e li abbiamo trapiantati in topi emofilici. Abbiamo iniettato 2.5x106 CK nella vena della coda di topi emofilici e dopo 3 giorni abbiamo eseguito il taglio della coda e abbiamo monitorato la sopravvivenza a 24 ore dei topi trapiantati verso i topi non trapiantati ed abbiamo visto che su 7 topi iniettati con cellule sane 5 sono sopravvissuti e in questi almeno 2 mostravano la presenza FVIII attivo. Mentre tutti i controlli sono deceduti dopo circa 6-8 ore. Infine studi di immunofluorescenza hanno dimostrato la presenza di CK nel fegato dei topi iniettati.
Questo lavoro ha stabilito che le CK di topo possono essere isolate e trapiantate nel fegato dei topi riceventi dove sopravvivono fino ad un periodo di 3 mesi e funzionano come cellule fagocitiche. Il trapianto di CK in un modello murino di emofilia ha dimostrato l'espressione di FVIII in quantità tali da garantire l'emostasi in un saggio a breve termine. Sicuramente il nostro lavora continuerà in futuro per stabilire se questi risultati potranno essere implementati in possibili possibili protocolli di terapia cellulare dell'Emofilia A. 
Collaborazioni in atto Sanjeev Gupta, MD
Albert Einstein College of Medicine, Liver Research Center, Dept Medicine & Pathology, 1300 Morris Park Avenue, New York, NY 10461, USA.

Laura SANTAMBROGIO, MD
Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 1300 Morris Park Avenue, New York, NY 10461, USA.

NANCY CARRASCO, MD
Albert Einstein College of Medicine, Department of Pharmacology, Bronx 10461, NY

Harris Goldstein, MD
Albert Einstein College of Medicine, Dept of Microbiology and Immunology
Bronx 10461,NY

Yelena Ginzburg, MD
New York Blood Bank, New York, NY

Stefano Rivella, PhD
Cornell University, New York, NY

VALDER ARRUDA, MD, PhD
The Children`s Hospital of Philadelphia
5056 Colket Translational Research Building
Philadelphia, PA 19104

Angel Raya, MD e Antonella Consiglio, PhD
Center for Regenerative Medicine in Barcelona, Dr. Aiguader 88, 08003 Barcelona, Spain. 
Comunicazioni a congressi Bone Marrow Transplantation Cures Hemophilia A
Antonia Follenzi, Sanj Raut, Simone Merlin, Rita Sarkar,Sanjeev Gupta
The 13th Annual Meeting of the American Society of Gene Therapy, Washington, DC (May 17- 22, 2010)
Molecular Therapy, Volume 18, Issue Supplement 1 (May 2010)

Long-Term Survival Of Primary Kupffer Cells After Transplantation Into Syngeneic Mouse Recipients
Follenzi AF, Merlin SM and Gupta SG
XVIII ESGCT Annual Meeting, Milan, Italy (22-25 October 2010)
HUMAN GENE THERAPY Volume: 21 Issue: 10 Pages: 1368-1368 Published: OCT 2010

Bone marrow transplantation cures hemophilia A
Follenzi AF, Raut SR, Merlin SM, and Gupta S
XVIII ESGCT Annual Meeting, Milan, Italy (22-25 October 2010)
HUMAN GENE THERAPY Volume: 21 Issue: 10 Pages: 1456-1456 Published: OCT 2010
 
Pubblicazioni
Inhibition of in vivo HIV infection in humanized mice by gene therapy of human hematopoietic stem cells with a lentiviral vector encoding a broadly neutralizing anti-HIV antibody.
Switching of mesodermal and endodermal properties in hTERT-modified and expanded fetal human pancreatic progenitor cells.
Dendritic cell-mediated in vivo bone resorption.
Hepcidin and Hfe in iron overload in beta-thalassemia.
Hepcidin as a therapeutic tool to limit iron overload and improve anemia in β-thalassemic mice.