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Responsabile Gianni Bona
Settore di ricerca Pediatria Generale e Specialistica
Personale docente Simonetta Bellone  Antonella Petri 
Personale non-docente Letizia Trovato  Gillian Elisabeth Walker  Stefania Riccomagno  Stefania Moia  Arianna Busti  Flavia Prodam      
Obiettivi della ricerca 1) Ricerca di geni candidati nella patogenesi della Bassa Statura Idiopatica (BSI) e della condizione SGA (Small Gestational Age)
Risultati ottenuti 1)  L'obiettivo del progetto è stato analizzare un pannello di geni specifici correlati al pathway cellulare JAK/STAT mediante RT2 Profiler PCR Arrays in soggetti con BSI, nati SGA senza recupero di crescita e normali per la statura. Dal nostro studio è emerso un diverso profilo di espressione genica nei due gruppi, infatti nella ISS il 75% dei geni è down-regolato, mentre nella condizione SGA il numero di geni up/down-regolati è pressoché simile (54% down-regolato, 46% up-regolato). In particolare, nella ISS è stata evidenziata una variazione di espressione non statisticamente significativa del GHR (p=0,63), di JAK2 (p=0,22) e delle STAT proteins (0.06<p<0.87) rispetto al gruppo di controllo, mentre è stato osservato un significativo aumento di espressione di CXCL9 (p=0,014). Un risultato simile, non statisticamente significativo, per la dimensione del campione, è stato osservato anche nella condizione SGA. L'aumento di espressione di mRNA di CXCL9 è stato confermato in un numero più ampio di soggetti ISS e SGA. Essendo CXCL9 una chemochina INFγ-indotta, è stato successivamente dimostrato che in entrambi i gruppi analizzati vi è un aumento di INFγ sia a livello di mRNA sia nel siero a livello di proteina (21,9 pg/ml±0,6 in soggetti ISS e 12,2 pg/ml±0,6 in soggetti SGA). Nei sieri del gruppo di controllo, i livelli di INFγ non sono stati quantificabili essendo inferiori a 0 pg/ml. Questi dati suggeriscono che alla base di queste alterazioni cliniche potrebbero esserci dei meccanismi infiammatori che al momento restano ancora da indagare. 
Obiettivi della ricerca 2) Analisi molecolare del gene GH-R in soggetti con bassa statura idiopatica e parziale insensibilità al GH
Risultati ottenuti 2) Abbiamo eseguito l'analisi molecolare del gene GH-R in 45 soggetti con BSI (24M/21F), livelli di IGF1 inferiori per età ai limiti di norma e scarsa risposta al GH. Sono stati identificati 5 polimorfismi già noti, rs6179 (A/G) nell'esone 6; rs6176 (C/T), rs6180 (A/C) e rs6182 (G/T) nell'esone 10, in condizioni sia di eterozigosi che di omozigosi; in 5 soggetti è stata trovata la delezione dell'esone 3. Le frequenze alleliche di questi SNPs risultano sovrapponibili a quelle trovate nel gruppo di controllo (40 soggetti). In 30 soggetti è stata identificata una nuova delezione di una G nell'introne 7, sia in eterozigosi che in omozigosi, con una frequenza per l'allele G sovrapponibile nei pazienti e nei controlli. In 4 soggetti è stata trovata la mutazione R179C non-sinonima in eterozigosi nell'esone 6 che determina una sostituzione aminoacidica Arg→Cys (CGC>TGC) a livello del dominio extracellulare del recettore; tale mutazione non è stata trovata nel gruppo di controllo. Abbiamo quindi iniziato studi funzionali in vitro e l'analisi al confocale ha evidenziato che il recettore, in entrambe le forme wt e mutata, viene espresso correttamente in membrana, suggerendo che tale mutazione non altera le caratteristiche strutturali del recettore. Successivi studi di binding chiariranno se tale mutazione altera l'affinità del recettore per il ligando e di conseguenza la trasduzione del segnale.
 
Obiettivi della ricerca 3) Il deficit di vitamina D3 modula l'insulino-resistenza nell'obesità pediatrica.
Risultati ottenuti 3) Sovrappeso ed obesità si associano allo sviluppo di insulino-resistenza (IR) e del diabete mellito tipo 2 (T2DM). Particolare interesse, invece, desta il ruolo emergente degli effetti della vitamina D3 sulla suscettibilità allo sviluppo di obesità, IR, T2DM. Scopo dello studio è stato valutare la prevalenza di deficit di vitamina D3 nella popolazione obesa pediatrica correlandola con i parametri auxologici e con gli indicatori metabolici di IR. I soggetti obesi prepuberi e puberi presentavano livelli di vitamina D3 paragonabili. Sulla base dei cut off standard dei livelli circolanti di vitamina D3 sono stati definiti 3 gruppi: Gruppo 1 (G1); insufficienza di vitamina D (25OHD3 <20.0 ng/ml; gruppo 2 (G2)ipovitaminosi D (25OHD3 ≥20.0 ng/ml ed < 30.0 ng/ml; 3 (G3) normale vitamina D (25OHD3 ≥30.0 ng/ml). Il 52.4% dei soggetti è risultato insufficiente di vitamina D3 (G1), il 25.2% con ipovitaminosi D3 (G2) ed il 21.7% non deficitario di vitamina D3 (G3).
Valutando tutto il gruppo, i livelli glicemici a digiuno sono risultati simili in G1, G2, e G3. I livelli di insulina a digiuno e l'AUC dopo OGTT sono risultati significativamente maggiori in G1 rispetto a G2 (p<0.02) e G3 (p<0.01). L'indice HOMA è risultato superiore ed il QUICKI inferiore nei G1 rispetto a G2 (p<0.04) e G3 (p<0.01). L'indice di acantosi è risultato maggiore nei G1 rispetto a G2 e G3 (p<0.01). I soggetti G1 non erano normalmente distribuiti in termine di massa grassa, infatti presentavano i centili del peso, BMI, i centili del BMI ed il BMI z score significativamente maggiori rispetto a G3 (p<0.01)..
Valutando solo i soggetti prepuberi, i soggetti G1, ma non G2, presentavano valori superiori di AUC dell'insulina all'OGTT (p<0.02). Valutando solo i soggetti puberi, i soggetti G1 presentavano valori superiori di insulina a digiuno (p<0.01), picco (p<0.01) e AUC di insulina all'OGTT (p<0.03), HOMA (p<0.003), indice di acantosi (p<0.007) e minori di ISI (p<0.01) e QUICKI (p<0.003) rispetto ai soggetti G3. Correggendo per i fattori confondenti (pubertà, BMI/BMI z score), i livelli ridotti di vitamina D3 non spiegavano l'incremento dei valori di insulina o degli indici di IR, ad eccezione dell'indice di acantosi in entrambi i gruppi (p<0.001).
Sulla base dell'analisi dei residui, si sono valutati i soggetti affetti da obesità grave (BMI>99° centile) come sottogruppo successivo. In questo sottogruppo, non si sono osservate differenze in termini di peso, BMI, BMI z score e circonferenza vita o fianchi. I soggetti G1 presentavano, nuovamente, maggiori livelli di insulina a digiuno (p<0.01), AUC di insulina all'OGTT (p<0.05), HOMA (p<0.003) e minori di QUICKI (p<0.003) rispetto ai soggetti G3.
Questi dati dimostrano che la prevalenza di deficit di vitamina D supera il 50% in un ampio gruppo di soggetti obesi in età pediatrica. I ridotti livelli di vitamina D3 sembrano associarsi con un incremento della IR ed una riduzione dell'insulino-sensibilità e tale effetto sembra in parte dipendente dall'eccesso ponderale.

 
Obiettivi della ricerca 4) Differente risposta di Ghrelin Acilato, Unacilato ed Obestatina al carico orale di glucosio nell`obesità pediatrica
Risultati ottenuti 4) Ghrelin acilato (AG), unacilato (UAG) ed obestatina sono ridotti nell'obesità e nella sindrome metabolica (SM), incrementati dal digiuno e sembrano essere regolati dal metabolismo glico-insulinemico. La regolazione fisiologica dei tre peptidi è ancora poco conosciuta, in particolare in età pediatrica. Scopo dello studio è stato valutare la regolazione della loro secrezione a digiuno e durante carico orale di glucosio (OGTT) nell'obesità pediatrica con e senza SM. AG, UAG, obestatina, glicemia ed insulina sono stati misurati a digiuno e durante OGTT in 60 soggetti prepuberi (PP-OB; 32) e puberi (P-OB; 28) obesi, classificati secondo i criteri IDF 2007 per la SM. Nel gruppo PP-OB, 20 soggetti (62.5%) presentavano SM. Nel gruppo P-OB, 28 soggetti (100%) presentavano SM. I soggetti P-OB presentavano livelli ridotti di UAG (p<0.004), obestatina (p<0.05) e quasi significativamente di AG (p=0.07) rispetto ai PP-OB. Durante l'OGTT in entrambi i gruppi: 1) i livelli di AG sono diminuiti a 60 minuti (p<0.04) per ritornare al basale a 120 minuti; 2) i livelli di UAG si sono mostrati ridotti per tutta la durata del test (p<0.0001) e più significativamente nei soggetti PP-OB (p<0.02); 3) i livelli di obestatina si sono ridotti a 120 minuti (p<0.04). I livelli a digiuno di UAG (p<0.01) e durante OGTT di obestatina (p<0.01) erano maggiormente ridotti nei soggetti con SM rispetto a quelli senza SM. I livelli a digiuno di UAG (p<0.05) ed obestatina (p<0.02) erano maggiormente ridotti nei soggetti con intolleranza glucidica rispetto a quelli euglicemici. In conclusione AG, UAG and obestatina presentano una differente risposta all'OGTT e la SM sembra influenzare la regolazione glucosio-indotta del sistema ghrelinergico nell'obesità pediatrica. 
Obiettivi della ricerca 5) Valutazione Proteomica di Neonati con Ipotiroidismo Congenito
Risultati ottenuti 5) L`Ipotiroidismo Congenito (IC) primario è la più frequente endocrinopatia dell`età evolutiva. Nel mondo, 1 neonato su 3000-4000 nati vivi è colpito da questa patologia causata, nella maggior parte dei casi, da alterazioni nell'embriogenesi della ghiandola tiroidea. Tali alterazioni si manifestano con assenza della ghiandola stessa (agenesia), ipoplasia, o con la presenza di abbozzi tiroidei in sede ectopica (ectopia), generalmente insufficienti ad assicurare un normale apporto di ormoni tiroidei. Lo scopo di questo nuovo studio è, pertanto, valutare la caratterizzazione proteomica su plasma dei differenti tipi di IC in condizioni basali, cioè al momento della diagnosi, ed in corso di trattamento sostitutivo con L-tiroxina dopo un periodo di osservazione di 4, 5, 6, 12 mesi e nelle successive fasi di crescita. I dati raccolti con lo studio proteomico, potranno caratterizzare maggiormente i differenti tipi di IC, fornendo eventuali marcatori precoci di IC e favorendo la valutazione dell'outcome terapeutico ed eventuali marcatori di compenso ormonale adeguato. Ad oggi, sono stati inclusi 4 pazienti con diagnosi confermata di IC studiati in diverse fasi di trattamento con L-tiroxina: 1 caso di agenesia (ICA), 2 casi di ipoplasia (ICI) e 1 caso di ectopia (ICE). Lo studio proteomico è stato eseguito per il soggetto ICA e un soggetto ICI al 10° giorno di vita (basale) e dopo 4 mesi di trattamento con L-tiroxina, usando l'elettroforesi bidimensionale (2D-electrophoresis), con spot proteici analizzati mediante PDQuest. Dopo aver separato le proteine in base all'alto peso molecolare (high molecular weight, HMW) e al basso peso molecolare (low molecular weight, LMW) per migliorare la risoluzione, il paziente ICA ha mostrato un aumento significativo di proteine plasmatiche HMW dopo 4 mesi di trattamento con L-tiroxina (ICA, P<0.033), mentre i cambiamenti dell'espressione proteica per il paziente ICI sono risultati modesti. è stata eseguita un'identificazione preliminare dei profili proteici risultati significativamente modificati in corso di trattamento, che in condizioni basali ha evidenziato una completa assenza di isoforme o frammenti proteolitici di aptoglobulina-β, tanto nel paziente ICA che nel paziente ICI. Dopo 4 mesi di L-tiroxina, il paziente ICA ha riacquisito una significativa espressione di aptoglobulina-β, mentre il paziente ICI ha presentato solo una modesta risposta al trattamento.
Sebbene l'orientamento degli studi futuri preveda di includere campioni plasmatici ottenuti da soggetti di controllo e di aumentare il numero dei soggetti studiati in relazione ai diversi tipi di IC, focalizzeremo la nostra attenzione anche sulla risoluzione dell'analisi dopo estrazione di albumina e IgG per amplificare il numero di altre proteine espresse ma mascherate da queste abbondanti proteine. L'analisi PDQuest prenderà in considerazione proteine i cui cambiamenti risulteranno significativi (>3 volte) e la cui identificazione verrà confermata con metodologie standard. Viceversa, le proteine isolate ma non note verranno sottoposte a procedura identificativa con spettrometria di massa.
 
Collaborazioni in atto   
Comunicazioni a congressi 91th Annual Meeting Endocrine Society, Washington June 10-13
S. Riccomagno, S. Moia, S. Bellone, A. Petri, L. Trovato, F. Prodam, G. Walker, M. Salerno, MC Valenzise, G. Bona. Molecular analysis of GHR gene in children with idiopathic short stature and partial GH insensitivity

91th Annual Meeting Endocrine Society, Washington June 10-13
S. Bellone, F. Prodam, I. Demarchi, I. Bonsignori, F. De Rienzo, A. Busti, G. Bona. Vitamin D deficit predicts insulin-resistance and high triglycerides levels in obese children.

European Congress of Endocrinology, 25-29 aprile 2009
F Prodam, S Bellone, L Trovato, E Grassino, S Moia, I Demarchi, F De Rienzo, G Aimaretti, G Bona. Ghrelin and obestatin levels in normal weight and obese prepubertal children.

48th European Society Pediatric Endocrinology (ESPE)
S Bellone, F Prodam, A Petri, S Moia, L Trovato, S Riccomagno, E Grassino, I Demarchi, G Bona. Acylated, unacylated ghrelin and obestatin regulation during oral glucose tolerance test in obese prepubertal and pubertal children

48th European Society Pediatric Endocrinology (ESPE)
Flavia Prodam, Simonetta Bellone, Letizia Trovato, Stefania Moia, Silvia Savastio, Francesca De Rienzo, Arianna Busti, Carla Guidi, Gianni Bona. Waist-to-height ratio is useful as BMI to identify high metabolic risk but does not predict ghrelin and adiponectin regulation in paediatric obesity.

XVII Congresso Nazionale SIEDP, Napoli 5-7 novembre
L. Trovato, S. Bellone, F. Prodam, F. De Rienzo, G. Genoni, S. Moia, S. Riccomagno, G. Walker, G. Bona. Valutazione del profilo genico del signaling JAK/STAT in bambini ISS, GHD e SGA

65° Congresso Nazionale Società Italiana Pediatria (SIP), Padova 27-30 novembre
L. Trovato, S. Bellone, F. Prodam, F. De Rienzo, S. Moia, S. Riccomagno, G. Bona. Valutazione del profilo genico del signaling JAK/STAT in bambini ISS e SGA
 
Pubblicazioni
Principal problems to cope with for a more efficient hospital care to the evolutive age patients: suggestions from the Italian Pediatrics Society (SIP).
Pediatricians, breast feeding and foreign mothers: a quali-quantitative study.
RotaTeq, a pentavalent rotavirus vaccine: efficacy and safety among infants in Europe.
The incidence of type 1 diabetes is increasing in both children and young adults in Northern Italy: 1984-2004 temporal trends.
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A recurrent signal peptide mutation in the growth hormone releasing hormone receptor with defective translocation to the cell surface and isolated growth hormone deficiency.
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