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Responsabile Renzo Boldorini
Settore di ricerca Anatomia Patologica
Personale docente Guido Monga   
Personale non-docente Claudia Veggiani  Alessia Paganotti  Umberto Miglio  Sara Allegrini  Ilenia Nestasio  Mauro Zaffaroni      
Obiettivi della ricerca 1) Analisi di sequenza dell'intera regione genomica codificante la proteina capsidica VP1 di BK Virus isolati da pazienti portatori di trapianto renale con nefropatia associata a Polyomavirus.
Risultati ottenuti 1)  Questo studio è stato condotto in collaborazione con il Laboratorio di Medicina Traslazionale dell'Università di Milano, e rappresenta il completamento di un precedente progetto iniziato dal nostro gruppo che aveva lo scopo di valutare se modificazioni delle sequenze genomiche delle varie regioni del genoma di BKV, codificanti e non, potessero conferire agli isolati virali una maggiore patogenicità nell'insorgenza di nefropatia associata a Polyomavirus (PAN), in analogia a quanto descritto nell'omologo Polyomavirus umano JCV in soggetti con PML. E' stata condotta analisi della sequenza genomica codificante per la proteina capsidica VP1, valutando la presenza di mutazioni nei loops BC, DE, EF, GH e HI. L'indagine è stata condotta su campioni di urina prelevati da 8 pazienti che hanno sviluppato PAN e da 7 pazienti controllo portatori di trapianto renale, ma che non hanno dimostrato evidenza di malattia. E' stata inoltre valutata la carica virale tramite real-time PCR quantitativa. Sostituzioni aminoacidiche sono state riscontrate in 6/8 (75%) pazienti affetti da PAN e in 6/7 (86%) pazienti controllo. Le mutazioni più frequenti in entrambi i due gruppi di campioni sono state riscontrate nei loops BC e EF, mentre non sono state trovate in alcun caso mutazioni nei loop GH e HI. I cambiamenti aminoacidici prevalenti nei campioni di pazienti PAN sono stati osservati in posizione 175, acido aspartico in acido glutammico (4/8 – 50%), e in posizione 210, valina in isoleucina (4/8 – 50%), mentre non è stato possibile identificare una mutazione prevalente nei pazienti controllo. La presenza di mutazioni in entrambi i gruppi suggerisce che non sembra esserci correlazione tra cambiamenti aminoacidici e insorgenza si PAN, inoltre, è stata osservata un'alta quantità di copie virali in entrambi i gruppi, dimostrando che la carica virale non è un marcatore predittivo per lo sviluppo di PAN. E' necessario ampliare ulteriormente la casistica per ottenere risultati statisticamente significativi 
Obiettivi della ricerca 2) Valutazione della possibile trasmissione verticale della infezione da Polyomavirus umani JCV e BKV con metodiche molecolari ed immunologiche.
Risultati ottenuti 2)  Questo lavoro è stato condotto in collaborazione con il Laboratorio di Microbiologia del Dipartimento di Pediatria della “Johns Hopkins” University School of Medicine di Baltimora e rappresenta il completamento di una indagine precedentemente svolta dal nostro gruppo (Boldorini et al., Pathology, 2008). Lo scopo del presente lavoro è verificare ed approfondire la frequenza di infezione/riattivazione dei PVs umani BKV e JCV e l'eventuale trasmissione verticale dell'infezione stessa. Lo studio è stato condotto su una popolazione di 19 donne con gravidanza fisiologica e patologica e sui rispettivi neonati. Durante questo studio sono stati raccolti e analizzati mediante metodiche molecolari sia qualitative che quantitative per la ricerca di genoma virale: A) campioni di urina e di siero provenienti dalle donne in gravidanza , B) campioni di siero fetale provenienti dal cordone ombelicale e C) campioni di siero, di secrezioni salivari e di urina appartenenti ai neonati. Inoltre sono stati condotti studi immunologici su tutti i campioni di siero, per la determinazione di immunoglobuline dirette contro specifici antigeni virali mediante metodica VLP-ELISA. I risultati di tale studio ci consentono di affermare che: 1) la trasmissione verticale dell'infezione da BKV e JCV non rappresenta una via prioritaria nella popolazione umana; 2) nelle donne in gravidanza sussiste una elevata frequenza di IgG anti-JCV e/o -BKV, a dimostrazione di una elevate diffusione della infezione da questi virus nella popolazione generale; 3) la riattivazione della infezione -evidenziata dalla identificazione di IgA e IgG specifiche anti- JCV e -BKV- è un evento relativamente frequente, ma che sembra essere limitato al solo compartimento uro-genitale, senza coinvolgimento sistemico; 4) l'infezione primaria non si manifesta frequentemente, mai nella nostra casistica e solo occasionalmente in altre casistiche più numerose.
 
Obiettivi della ricerca 3) Ricerca di sequenze genomiche di Polyomavirus umani in feti da aborto spontaneo o terapeutico.
Risultati ottenuti 3)  Questa ricerca è stata condotta per valutare l'eventuale correlazione tra abortività e infezione congenita da Polyomavirus umani. Per lo studio sono stati analizzati materiali abortivi (feti e placente) di 10 casi di aborti spontanei e terapeutici. E' stata indagata la presenza di genoma di BKV tramite amplificazione della regione VP1 e della regione TCR tramite metodica Emi-Nested PCR ed è stata eseguita genotipizzazione di entrambe le regioni mediante sequenziamento diretto. Sugli stessi campioni è stata eseguita l'analisi immuno-istochimica. BKV è stato identificato in 7 di 10 feti (70%), mediante amplificazione delle regioni VP1 e TCR; in particolare dei 60 campioni analizzati, corrispondenti al materiale fetale, 23 campioni risultavano essere positivi (38% circa). Tuttavia in soli tre campioni fetali è stato possibile amplificare entrambe le regioni genomiche. Il genotipo più frequente per VP1 è risultato essere il tipo I MM (87.5%), mentre per TCR non è stato individuato un genotipo prevalente, bensì una distribuzione più omogenea caratterizzata da BKV WWT, BKV WW e BKV 128-I. L'unico campione di placenta positivo evidenziava positività della regione VP1 con genotipo IV GS. L'analisi immuno-istochimica è risultata negativa su tutti i campioni. L'indagine all'interno degli organi non ha identificato un organo principale di latenza, ma una diffusione random. I risultati mostrano la possibile trasmissione trans-placentare di BKV, anche se l'amplificazione delle sequenze genomiche e la scarsa variabilità genomica hanno evidenziato lo stato lo stato di latenza virale, in multipli organi fetali, senza una prevalenza dei cosiddetti organi bersaglio. Come dimostra la positività del tessuto placentare, la riattivazione virale sembra avvenire solo durante alcune fasi della gravidanza e in modo focale. E' possibile che l'infezione da BKV si correli ad una maggiore frequenza di abortività, mentre non si sono osservate correlazioni tra presenza di malformazioni e infezione virale. 
Collaborazioni in atto Prof. Kamel Khalili,
Department of Biology - Center for Neurovirology and Cancer Biology
203 Biology-Life Sciences Building
Temple University
Philadelphia, PA 19122
USA

Prof. Raphael Viscidi,
Department of Molecular Microbiology and Immunology
Johns Hopkins University
Baltimora
USA

Dott. Milo Frattini,
Laboratorio di Diagnostica Molecolare
Istituto Cantonale di Patologia
6601 Locarno
Svizzera 
Comunicazioni a congressi   
Pubblicazioni
Genomic mutations of viral protein 1 and BK virus nephropathy in kidney transplant recipients.
Detection, distribution, and pathologic significance of BK virus strains isolated from patients with kidney transplants, with and without polyomavirus-associated nephropathy
Primary choroid plexus papilloma of the sacral nerve roots