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Responsabile Maria Prat
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Antonia Follenzi   
Personale non-docente Stefano PIetronave  Michele Iafisco  Simone Merlin  Deborah Locarno  Andrea Zamperone  Aida  Aulicino  Giorgia Drera   
Obiettivi della ricerca 1) Analisi del potenziale oncogenico di forme tronche di Met prive dell'ectodominio
Risultati ottenuti 1) Questo proto-oncogene può acquisire potenziale oncogenico con meccanismi diversi: riarrangiamento genico, amplificazione, iperespressione, mutazione puntiforme ed espressione ecctopica, che risultano in una sua attivazione costitutiva. Abbiamo ora dimostrato che in fibroblasti murini esprimenti la forma tronca di Met priva dell'ectodominio, a seguito di infezione con un vettore Lentivirale, la proteina Met e i trasduttori MAPK e Akt sono costitutivamente attivati. Queste cellule crescono in modo indipendente da ancoraggio, invadono una matrice extracellulare che riproduce la membrana basale e, se inoculate sottocute in topi nudi, provocano tumori palpabili. Si ipotizza quindi che in condizioni fisiologiche l`ectodominio di Met giochi il ruolo di regolatore negativo dell`attività del recettore (Merlin et al. Cancer Sci. 100 :633-638, 2009). 
Obiettivi della ricerca 2) Analisi del potenziale anti-apoptotico di anticorpi monoclonali agonisti del recettore Met su cardiomiociti
Risultati ottenuti 2) L'HGF, un fattore pleiotropico con attività mitogenica, motogenica, morfogenica e anti-apoptotica su diversi tipi cellulari, ha un effetto positivo sul miocardio. Poiché tutte le risposte biologiche evocate da HGF sono mediate dal suo recettore, abbiamo utilizzato anticorpi monoclonali (mAb) agonisti del recettore come fattori anti-apoptotici per le linee miocardiche H9c2 e HL-5 di roditore. Gli anticorpi proteggono dall'apoptosi indotta da stress ossidativo dovuto a trattamento transiente con H2O2 sia secondo parametri morfologici (formazione di corpi apoptotici, condensazione del DNA) che biochimici (positività all'Annexin V, traslocazione di bax ai mitocondri, attivazione di caspasi, frammentazione del DNA), in modo MAPK Erk1/2 e PI 3-kinase dipendente. In queste cellule l'anticorpo può quindi essere un valido sostituto dell'HGF, con i vantaggi di essere molto più stabile, facilmente ottenibile in forma attiva e altamente pura (Pietronave et al., American Journal of Physiology, Heart and Circulation Physiology, in press) 
Obiettivi della ricerca 3) Nanoparticelle inorganiche funzionalizzate con anticorpi monoclonali per il “targeting” di chemioterapici su cellule tumorali
Risultati ottenuti 3) Il problema principale della chemoterapia anti-tumorale convenzionale è la mancanza di specificità, il che comporta gravi effetti collaterali generalmente associati alla dose di farmaco necessaria perchè sia efficace. La nanoterapia applicata nel campo oncologico, basata su nanoparticelle (NP) multifunzionali rappresenta una promettente opportunità che dovrebbe essere in grado di superare questi limiti. Infatti, per le loro caratteristiche fisico-chimiche, le nanoparticelle presentano i seguenti vantaggi: le dimensioni nanometriche ne evitano la cattura da parte dei macrofagi, permettendo loro di permanere nel circolo sanguigno per periodi prolungati; queste nanoparticelle possono attraversare la parete endoteliale, che nei tumori è più permeabile (effetto di permeabilità e ritenzione) e veicolare agenti terapeutici poco solubili e proteggerli da una degradazione prematura. Quando funzionalizzate con ligandi che riconoscono marcatori tumore-associati, permettere un “targeting” specifico sulle cellule tumorali, consentendo di diminuire la quantità di farmaco e quindi di ridurre gli effetti secondari di tossicità aspecifica sistemica. (Pietronave et al., Journal of Applied Biomaterials & Biomechanics 2009; 7: 77-89).
Obiettivo di questo progetto appena iniziato è quindi produrre NP ternarie di idrossiapaptite o silica (materiale inorganico completamente biocompatibile e riassorbibile), funzionalizzate con un chemioterapico (ad esempio doxorubicina, cisplatino) e anticorpi monoclonali diretti contro marcatori tumorali associati, come componenti per il “targeting”.  
Obiettivi della ricerca 4) Ruolo del microambiente nel differenziamento di cellule staminali adulte da tessuto adiposo (ADSC) verso fenotipi diversi
Risultati ottenuti 4) è noto che la frazione stromale del tessuto adiposo contiene una riserva di cellule indifferenziate con alto potenziale differenziativo. ADSC sono state per ora ottenute da tessuto adiposo murino della regione inguinale, e dal tessuto adiposo epicardico di maiale e di uomo (ottenuto il consenso informato), con metodiche classiche, e sono state mantenute in coltura cellulare per un certo numero di passaggi (fino al 26°). Le cellule sono state caratterizzate per il fenotipo biochimico (marcatori di staminalità quali Sca-1, Kit, …), capacità di proliferare (cinetiche di doubling times), e multipotenzialità (induzione al differenziamento osteogenico, adipogenico, endoteliale). è stata ottenuta una linea che mantiene le caratteristiche biochimiche originali testate, che è arrivata oltre il passaggio 70 (circa 18 mesi di coltura) e che mantiene la multipotenzialità. Sono in corso esperimenti di caratterizzazione analoga per le cellule derivate dall'epicardio di maiale e di uomo. è previsto che in futuro si utilizzi come sorgente di ADSC materiale ottenuto da tessuto adiposo sottocutaneo umano. Questa ricerca pone le basi per un progetto che prevede di indurre ADSC al differenziamento miocardico inserendole in strutture 3D, in presenza di fattori di crescita/sopravvivenza/differenziamento e molecole di adesione. Tali strutture verranno coltivate in bioreattori (progetto in collaborazione con Politecnico di Milano). 
Obiettivi della ricerca 5) Produzione di anticorpi monoclonali diretti contro epitopi del dominio extracellulare del recettore Met tramite la tecnica del “phage display”
Risultati ottenuti 5) Si è prodotta una libreria di anticorpi in formato scFv (single chain Fragment variable) a partire dai geni di immunoglobuline espressi nei linfociti splenici di topi immunizzati contro il recettore Met. Da questa verranno selezionati anticorpi diretti verso epitopi diversi del recettore. Le molecole così selezionate verranno quindi ingegnerizzate in formati diversi (essenzialmente bivalenti, quali “diabodies” o “minibodies”), in modo da indurre la dimerizzazione del recettore e perciò essere in grado di attivarlo, come gli anticorpi convenzionali. Questi anticorpi di nuova generazione presenteranno i seguenti vantaggi rispetto al ligando naturale HGF: maggiore stabilità, minori costi, possibilità di indurre una risposta biologica parziale (ad esempio: solo protezione e differenziamento, ma non proliferazione). Inoltre, rispetto agli anticorpi convenzionali presenteranno i seguenti vantaggi: essendo dotati di minor massa (circa 50-75 kDa contro 150 kDa) ed essendo monocatenari, a) essi consentono una più facile produzione in cellule procariote su larga scala e con costi minori e b) hanno migliore capacità di penetrazione in strutture tridimensionali. Infine gli anticorpi ricombinanti prodotti da librerie di geni umani sono completamente umani e perciò privi di immunogenicità, qualora se ne prospetti un potenziale uso terapeutico in vivo (progetto in collaborazione con Prof Sblattero – Biologia Applicata).  
Collaborazioni in atto Azioni Integrate Italia Spagna: titolo del progetto di ricerca: Multifunctional drug-loaded antibody-targeted inorganic nanoparticles for biomedical use (coordinatore spagnolo Jaime Gómez Morales) 
Comunicazioni a congressi Michele Iafisco, Maria Prat, Lia Rimondini, Norberto Roveri
Biomimetic hydroxyapatite nanoparticles as carriers for proteins and antibodies
PROSURF WORKSHOP, “Protein Surface Interaction” Sestri Levante (GE), 2009.

S. Mele, S. Pietronave, A. Zamperone, E. Battistella, M. Prat and L. Rimondini
Proliferation and differentiation potential of mouse adipose derived stromal cells on Titanium Scaffolds
European Science Foundation Workshop on Bone Stem Cells, Bertinoro (FO), 2009.

S. Pietronave1, G. Forte2, A. Zamperone1, D. Locarno1, C. Comoglio3, M. Ribetto3, M. Boffini3, M. Rinaldi3, P. Di Nardo2 and M. Prat1
Extraction and characterization of cardiac progenitor cells (CPCS) to generate engineered cell sheets
LXIII Congresso Nazionale Società Italiana di Anatomia e Istologia, Torino, 2009.

Andrea Zamperone, Stefano Pietronave, Valeria Passarino, Maria Prat
Characterization of a spontaneously immortalized multipotent cell line from mouse subcutaneous adipose tissue.
LXIII Congresso Nazionale Società Italiana di Anatomia e Istologia, Torino, 2009.

S. Pietronave1, G. Forte2, A. Zamperone1, D. Locarno1, C. Comoglio3, M. Ribetto3, M. Boffini3, M. Rinaldi3, P. Di Nardo2 and M. Prat1
Preparation of engineered cell sheets made of human cardiac progenitor cells (CPCS)
XVI Congresso Nazionale della Società Italiana di Ricerche Cardiovascolari, Imola, 2009

S. Pietronave, M. Prat
Fabrication of engineered tissues using human cardiac progenitor cells (CPCs)
WORKSHOP “CELL & TISSUE THERAPY, A TECHNICAL AND SOCIAL CHALLENGE” Tokyo 2009
 
Pubblicazioni
Deletion of the ectodomain unleashes the transforming, invasive, and tumorigenic potential of the MET oncogene.
Functionalized nanomaterials for diagnosis and therapy of cancer.
Co-expression of plexin-B1 and Met in human breast and ovary tumours enhances the risk of progression.