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Responsabile Mara Giordano
Settore di ricerca Genetica Medica
Personale docente    
Personale non-docente Michela Godi  Nadia Barizzone  Simona Mellone               
Obiettivi della ricerca 1) Identificazione di una variazione funzionale nel gene GHRHr (Growth hormone releasing hormone receptor) associata a deficit isolato di GH (IGHD)
Risultati ottenuti 1) Nel 10% dei pazienti con IGHD di tipo IB (autosomico recessivo) sono riportate mutazioni causali in omozigosi o eterozigosi composta nel GHRHr. Analizzando questo gene in pazienti sporadici, abbiamo identificato una variazione in eterozigosi Val10Gly nel peptide segnale in 3/131 casi (ereditata da genitori con statura normale) e in 1/978 controlli (p=0,001). Il Western-blot dell'estratto di cellule CHO transfettate rispettivamente con i costrutti contenenti il cDNA-GHRHr mutato (10-Gly) e il cDNA wild-type (10-Val) mostrava una banda di circa 48 Kda (10-Gly) e 45 Kda (10-Val), verosimilmente corrispondenti al recettore con e senza peptide segnale. Nelle cellule transfettate con entrambi i costrutti, che riproduce la situazione dei pazienti eterozigoti, erano presenti entrambe le bande.
Studi di immunofluorescenza hanno evidenziato che in cellule non permeabilizzate transfettate separatamente con i due costrutti, il GHRHr 10-Gly non viene espresso in membrana, a differenza di 10-Val. In cellule transfettate con entrambi, il recettore è presente. Stiamo effettuando su queste un'analisi quantitativa. Questi risultati suggeriscono che Val10Gly interferisce con il processamento del recettore maturo, impedendo il taglio del peptide segnale e quindi l'espressione in membrana. E' probabile che in questi tre pazienti l'IGHD sia dovuto alla concomitante presenza di variazioni in altri geni suggerendo che in questa patologia esiste anche una forma di eredità oligogenica.
  
Obiettivi della ricerca 2) -Identificazione di polimorfismi nel primo introne del gene PROP-1 associati al deficit combinato di ormone della crescita (CPHD)
Risultati ottenuti 2) Mutazioni a carico del gene PROP-1 (Prophet of Pit-1) rappresentano una delle cause più comuni di CPHD (Combined Pituitary Hormone Deficiency). Al fine di identificare varianti polimorfiche in PROP-1 associate al CPHD è stata analizzata una sequenza del primo introne conservata nelle specie e avente funzione di enhancer nel topo.
L'analisi è stata effettuata mediante sequenziamento diretto su 72 pazienti CPHD in cui erano state escluse mutazioni a carico di PROP-1 e su 420 controlli. Sono state identificate 4 variazioni: una sostituzione nucleotidica G/A in posizione IVS1+435 e una delezione di tre basi (TAG) in posizione IVS1+915, oltre a 2 SNPs già noti (rs4498267 C/T e rs4431364). Su queste variazioni è stato effettuato uno studio di associazione caso-controllo da cui è emerso che solo i due nuovi polimorfismi mostravano un'associazione significativa al CPHD. In particolare, l'aplotipo IVS1+435 A e IVS1+915 delTAG risultava associato con un valore più significativo rispetto a quello mostrato dai singoli polimorfismi (p=0.0012).
Per valutare l'eventuale significato funzionale delle due variazioni e confermare il ruolo di enhancer della regione in esame anche nell'uomo sono stati preparati 4 costrutti contenenti le possibili combinazioni aplotipiche generate dai 2 polimorfismi in orientamento sense o antisense rispetto ad un promotore minimo TK.
E' in corso lo studio dell'attività trascrizionale di PROP-1 mediante saggi di luciferasi.

Mutazioni a carico del gene PROP-1 (Prophet of Pit-1) rappresentano una delle cause più comuni di CPHD (Combined Pituitary Hormone Deficiency). Al fine di identificare varianti polimorfiche in PROP-1 associate al CPHD è stata analizzata una sequenza del primo introne conservata nelle specie e avente funzione di enhancer nel topo.
L'analisi è stata effettuata mediante sequenziamento diretto su 72 pazienti CPHD in cui erano state escluse mutazioni a carico di PROP-1 e su 420 controlli. Sono state identificate 4 variazioni: una sostituzione nucleotidica G/A in posizione IVS1+435 e una delezione di tre basi (TAG) in posizione IVS1+915, oltre a 2 SNPs già noti (rs4498267 C/T e rs4431364). Su queste variazioni è stato effettuato uno studio di associazione caso-controllo da cui è emerso che solo i due nuovi polimorfismi mostravano un'associazione significativa al CPHD. In particolare, l'aplotipo IVS1+435 A e IVS1+915 delTAG risultava associato con un valore più significativo rispetto a quello mostrato dai singoli polimorfismi (p=0.0012).
Per valutare l'eventuale significato funzionale delle due variazioni e confermare il ruolo di enhancer della regione in esame anche nell'uomo sono stati preparati 4 costrutti contenenti le possibili combinazioni aplotipiche generate dai 2 polimorfismi in orientamento sense o antisense rispetto ad un promotore minimo TK.
E' in corso lo studio dell'attività trascrizionale di PROP-1 mediante saggi di luciferasi.


Mutazioni a carico del gene PROP-1 (Prophet of Pit-1) rappresentano una delle cause più comuni di CPHD (Combined Pituitary Hormone Deficiency). Al fine di identificare varianti polimorfiche in PROP-1 associate al CPHD è stata analizzata una sequenza del primo introne conservata nelle specie e avente funzione di enhancer nel topo.
L'analisi è stata effettuata mediante sequenziamento diretto su 72 pazienti CPHD in cui erano state escluse mutazioni a carico di PROP-1 e su 420 controlli. Sono state identificate 4 variazioni: una sostituzione nucleotidica G/A in posizione IVS1+435 e una delezione di tre basi (TAG) in posizione IVS1+915, oltre a 2 SNPs già noti (rs4498267 C/T e rs4431364). Su queste variazioni è stato effettuato uno studio di associazione caso-controllo da cui è emerso che solo i due nuovi polimorfismi mostravano un'associazione significativa al CPHD. In particolare, l'aplotipo IVS1+435 A e IVS1+915 delTAG risultava associato con un valore più significativo rispetto a quello mostrato dai singoli polimorfismi (p=0.0012).
Per valutare l'eventuale significato funzionale delle due variazioni e confermare il ruolo di enhancer della regione in esame anche nell'uomo sono stati preparati 4 costrutti contenenti le possibili combinazioni aplotipiche generate dai 2 polimorfismi in orientamento sense o antisense rispetto ad un promotore minimo TK.
E' in corso lo studio dell'attività trascrizionale di PROP-1 mediante saggi di luciferasi.
Mutazioni a carico del gene PROP-1 (Prophet of Pit-1) rappresentano una delle cause più comuni di CPHD (Combined Pituitary Hormone Deficiency). Al fine di identificare varianti polimorfiche in PROP-1 associate al CPHD è stata analizzata una sequenza del primo introne conservata nelle specie e avente funzione di enhancer nel topo.
L'analisi è stata effettuata mediante sequenziamento diretto su 72 pazienti CPHD in cui erano state escluse mutazioni a carico di PROP-1 e su 420 controlli. Sono state identificate 4 variazioni: una sostituzione nucleotidica G/A in posizione IVS1+435 e una delezione di tre basi (TAG) in posizione IVS1+915, oltre a 2 SNPs già noti (rs4498267 C/T e rs4431364). Su queste variazioni è stato effettuato uno studio di associazione caso-controllo da cui è emerso che solo i due nuovi polimorfismi mostravano un'associazione significativa al CPHD. In particolare, l'aplotipo IVS1+435 A e IVS1+915 delTAG risultava associato con un valore più significativo rispetto a quello mostrato dai singoli polimorfismi (p=0.0012).
Per valutare l'eventuale significato funzionale delle due variazioni e confermare il ruolo di enhancer della regione in esame anche nell'uomo sono stati preparati 4 costrutti contenenti le possibili combinazioni aplotipiche generate dai 2 polimorfismi in orientamento sense o antisense rispetto ad un promotore minimo TK.
E' in corso lo studio dell'attività trascrizionale di PROP-1 mediante saggi di luciferasi.




  
Obiettivi della ricerca 3) RICERCA DI FATTORI GENETICI DI SUSCETTIBILITÀ ALLA MALATTIA CELIACA NELLA REGIONE 5Q31-33
Risultati ottenuti 3)   La malattia celiaca (MC) è una patologia multifattoriale immunologicamente determinata, caratterizzata da malassorbimento e danni alla mucosa dell`intestino tenue. Il principale fattore di rischio genetico per la MC risiede nella regione HLA. Più del 90% dei pazienti MC sono portatori dell`eterodimero HLA-DQ2. Sebbene necessario, l`HLA da solo non è sufficiente per la manifestazione della malattia e non spiega l`intera suscettibilità genetica. Infatti il 30% della popolazione possiede gli alleli HLA di suscettibilità ma, pur ingerendo glutine, non sviluppa la MC.
Lo scopo di questa ricerca è l'identificazione di fattori genetici in una regione di circa 40 Mb sul cromosoma 5 (5q31-33), identificata mediante studi di linkage e replicata in popolazioni diverse. La regione candidata più probabile si restringe a circa 9Mb e contiene 52 geni noti. Con l'obiettivo di identificare il gene di suscettibilità in questa regione abbiamo condotto una ricerca sistematica di associazione tra la malattia e SNP in questi geni mediante uno studio caso-controllo con il metodo dei pool di DNA, precedentemente messo a punto nel nostro laboratorio.
Le frequenze alleliche di 299 SNPs in 72 geni compresi nella regione di 40 cM sul 5q ( 5q31-33) sono state determinate in 2 pool di DNA e 2 pool di controlli. Degli SNPs esaminati 48 erano localizzati nelle sequenze codificanti, di cui 27 erano sostituzioni non sinonime. Cinquantadue dei geni testati e 211 SNPs mappavano nell'intervallo di 9cM tra i micro satelliti D5S402 e D5S410, dove con una probabilità dell'82.1% dovrebbe essere localizzato il gene di suscettibilità alla celiachia.
Le 12 variazioni che hanno mostrato una differenza di frequenza maggiore del 4% fra pool di pazienti e pool di controlli sono state analizzate mediante la tecnica SNaPshot in un campione indipendente di 266 famiglie nucleari (paziente ed i suoi genitori) mediate il metodo AFBAC, considerando gli alleli trasmessi e non trasmessi dai genitori al figlio affetto come casi e controlli rispettivamente.
Uno SNP nel 3'UTR del gene MFAP3 (microfibril-associated protein-3) e uno SNP intronico nel gene LCP2 (lymphocyte cytosolic protein 2) hanno mostrato una differenza di frequenza nella stessa direzione dei pool. Analizzando globalmente i dati di questi due SNPs ottenuti dall'analisi dei pools e dall'AFBAC è risultato per entrambi un OR protettivo conferito dall'allele minore di 0.83/0.84 (p=0.02) che si traduce in un OR di 1.2 per l'allele più frequente. Dato che l'analisi mediante pool consente solo la determinazione delle frequenze alleliche e' in corso l'analisi dei singoli campioni che compongono i pools per valutare le frequenze genotipiche.
 
Collaborazioni in atto   
Comunicazioni a congressi S.Mellone, M.Mellai, N.Barizzone, E.Bolognesi, P. Momigliano-Richiardi, L.Greco , M.Giordano
RICERCA DI FATTORI GENETICI DI SUSCETTIBILITÀ ALLA MALATTIA CELIACA NELLA REGIONE 5q31-33. 1-3 Ottobre 2009 XVI Congresso Nazionale AIBT, Verbania (NO)

IDENTIFICAZIONE DI POLIMORFISMI NEL PRIMO INTRONE DEL GENE PROP-1 ASSOCIATI AL DEFICIT COMBINATO DI ORMONE DELLA CRESCITA (CPHD)
M.Godi1, S. Mellone, R. Marabese, A. Petri2, S. Bellone, G. Bona, Patricia Momigliano-Richiardi, M. Giordano
XII Congresso Nazionale SIGU, 8-10 novembre 2009 Torino


 
Pubblicazioni
A recurrent signal peptide mutation in the growth hormone releasing hormone receptor with defective translocation to the cell surface and isolated growth hormone deficiency.
A novel recessive splicing mutation in the POU1F1 gene causing combined pituitary hormone deficiency.