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Responsabile Antonia Follenzi
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Maria Prat   
Personale non-docente Simone Merlin  Gabriella Ranaldo  Ester Borroni  Diego Zanolini            
Obiettivi della ricerca 1) Isolamento di cellule di Kupffer dal fegato di topo, differenziamento in vivo di macrofagi da midollo osseo e trapianto in topi emofilici
Risultati ottenuti 1) In questo progetto abbiamo ottimizzato un protocollo per l'isolamento di cellule Kupffer dal fegato e per la differenziazione ex-vivo di macrofagi derivati da midollo osseo e loro relativo trapianto nel fegato di topi intatti o condizionati da diversi agenti epatotossici. Le cellule isolate da fegato o differenziate da midollo osseo sono state utilizzate in protocolli di terapia cellulare in particolare l`emofilia A. All`analisi citofluorimetrica a flusso queste cellule esprimono i marcatori tipici di superficie, CD11b, F4/80 e in saggi specifici hanno dimostrato di essere cellule dotate di attività fagocitica. Queste cellule sono state trapiantate nel fegato di topi con iniezione intraportale e abbiamo visto che dopo iniezione intraporta si localizzano nel fegato e ci rimangono almeno fino a 3 mesi. Mentre i macrofagi differenziati da midollo non attecchiscono nel fegato e dopo 48 ore non si riesce più a localizzarle in nessun organo. Le cellule del kupffer sono capaci di rispondere a stimoli infiammatori come LPS e indurre l`espressione di IL-6, verificando la funzionalità delle cellule trapiantate.
Infine abbiamo isolato cellule del Kupffer da topi normali e le abbiamo trapiantate in topi emofilici (3 X10e6 cellule per topo) e abbiamo valutato la sopravvivenza di questi topi dopo taglio della coda dopo 3 giorni ed una settimana e abbiamo osservato che dopo 3 giorni tutti i topi trapiantatoi sono sopravvissuti mentre dopo una settimana solo il 50% dei topi è sopravvissuto ad indicare una parziale correzione nel tempo dovuta al fatto che magari il numero delle cellule trapiantate è stato insufficiente e alcune cellule sono morte nel giro di una settimane se non attecchiscono nell`organo di loro competenza. Ci riserviamo di andare a fondo di questi studi trapiantando un numero maggiore di cellule per topo e di trapiantare un numero maggiore di topi.
 
Obiettivi della ricerca 2) Terapia genica della Beta-thalassemia con iperespressione della transferrina mediante mediante l'uso dei vettori lentivirali
Risultati ottenuti 2) Si intende dimostrare che l'iperespressione cronica di transferrina umana (hTf) è in grado di far regredire l'anemia e l'eccesso di ferro accumulato nei topi Beta-talassemici. Nel contesto dei VL i promotori che guidano l'espressione della transferrina sono il promotore ubiquitario della fosfoglicerato chinasi (PGK) e il promotore epato-specifico transtiretina (TTR). Gli obiettivi sono suddivisi in: A) Saggio in vitro dei costrutti lentivirali esprimenti la hTf; B) Valutazione delle funzioni fisiologiche della hTf quando espressa in vivo nei topi talassemici a lungo termine.
La transferrina è stata sottoclonata nei costrutti di trasferimento lentivirale sotto il controllo dei promotori PGK e TTR . I VL sono stati ottenuti mediante cotrasfezione nelle cellule 293T e validati in vitro. Le particelle di VL concentrate per ultracentrifugazione e titolate su cellule Hepa1, linea di epatociti murini. Abbiamo verificato l'espressione della hTf mediante western blotting (WB) con un anticorpo specifico. I supernatanti delle cellule trasdotte sono stati analizzati mediante il saggio funzionale della capacità della transferrina di legare il ferro (TIBC). Abbiamo verificato l'espressione epato-specifica mediante il paragone tra epatociti primari (permissivi ad entrambi i promotori) e le cellule endoteliali dei sinusoidi epatici (permissive solo per il PGK). Abbiamo iniettato i VL nella vena della coda di topi Hbbth1/th1 e in topi normali di controllo di circa 5-7 settimane di età, alcuni topi di controllo hanno ricevuto VL con GFP. Abbiamo iniettato nei topi 1x109 TU/topo paragonando l'espressione di transferrina sotto il controllo dei 2 promotori. Stiamo valutando la biodistribuzione del DNA del vettore a diversi intervalli dopo l'iniezione nel fegato, milza, midollo osseo, polmoni, reni, e cuore dei topi iniettati mediante Q-PCR. Infine stiamo valutando l'espressione duratura nel tempo della transferrina nel siero dei topi iniettati dopo 1, 2, 4 e 12 settimane mediante WB e misureremo i livelli di transferrina umana presenti nel siero dei topi. Questi studi stabiliranno se l'iperespressione a lungo termine della hTf è efficace e priva di effetti collaterali nel migliorare la patologia dei topi talassemici e generare dati pre-clinici validi per considerare l'applicazione clinica in futuro.
 
Obiettivi della ricerca 3) Utilizzo di progenitori ematopoietici derivati da midollo per la terapia cellulare dell'Emofilia A
Risultati ottenuti 3) Dimostrare che la ricostituzione con un pool di cellule di origine extraepatica è in grado di produrre FVIII e di curare l'emofilia A. In particolare vogliamo esplorare il potenziale terapeutico di cellule di midollo e di sangue di cordone umano nella terapia dell'Emofilia A. Questo verrà perseguito attraverso due tappe successive: A) i) Dimostrare che le cellule di midollo e di sangue di cordone, oltre a esprimere mRNA per FVIII, secernono la proteina e, dopo separazione di sottopopolazioni cellulari, identificare quali cellule producono FVIII e sono quindi potenzialmente in grado di correggere il fenotipo dei topi emofilici. ii) Differenziare le cellule derivate dal midollo osseo e dal sangue di cordone in cellule mesenchimali e mononucleate in grado di esprimere e secernere FVIII in vitro. B) Dimostrare se il trapianto di midollo con cellule di midollo o di sangue da cordone umano in topi NOD/SCID emofilici irradiati con una dose di radiazioni sub-letale è in grado di i) ripopolare la frazione mesenchimale e monocitica del midollo e ii) correggere il fenotipo dei topi emofilici. METODI A) i) Il midollo totale e il sangue di cordone saranno saggiati per l'espressione e la secrezione di FVIII in coltura. Stiamo analizzando l'espressione di FVIII nelle diverse popolazioni cellulari sia come mRNA mediante RT-PCR qualitativa e quantitativa, utilizzando oligonucleotidi disegnati sulla sequenza umana e già validati su epatociti umani, sia come proteina secreta nei superrnatanti delle colture cellulari mediante saggio ELISA dopo l'aggiunta di fattore di vWF stabilizzatore del FVIII. ii) Dopo aver analizzato il midollo e il sangue di cordone totale, procederemo al frazionamento delle cellule mediante metodiche immunomagnetiche, per individuare la sotto-popolazione cellulare che produce FVIII. B) Stiamo programmando anche studi in vivo che verranno eseguiti su topi emofilici su background NOD-SCID, che sono in grado di sostenere il trapianto di cellule umane.
Questi studi stabiliranno se il trapianto con cellule derivate da midollo o da sangue di cordone è in grado di correggere il fenotipo emorragico dei topi emofilici. Inoltre genereranno dati pre-clinici da considerare nell'ottica della possibilità di trapianto di midollo in pazienti affetti da emofilia A. Il trapianto di midollo è ormai una procedura standard nella cura di patologie ematologiche e lo sviluppo di protocolli appropriati potrebbero essere un valido contributo nella ricerca di una terapia adatta per l'emofilia.
 
Collaborazioni in atto Sanjeev Gupta, MD
Albert Einstein College of Medicine, Liver Research Center, Dept Medicine & Pathology
Bronx 10461, NY

Laura Santambrogio, MD, PhD
Albert Einstein College of Medicine, Dept of Pathology
Bronx 10461, NY

Harris Goldstein, MD
Albert Einstein College of Medicine, Dept of Microbiology and Immunology
Bronx 10461,NY

Nancy Carrasco, MD.
Albert Einstein College of Medicine, Department of Molecular Pharmacology, Bronx 10461, NY

Angel Raya, MD e Antonella Consiglio, PhD
Center for Regenerative Medicine in Barcelona, Dr. Aiguader 88, 08003 Barcelona, Spain.

Yelena Ginzburg, MD
New York Blood Center, New York, USA 
Comunicazioni a congressi Follenzi A, "Bone marrow transplantation Corrects the Bleeding Phenotype of Hemophilia A Mice" NHF`s 10th Workshop on Novel Technologies and Gene Transfer for Hemophilia. 5-6 February 2010 Chapel Hill, NC

Follenzi A, Merlin S, Prat M, Gupta S “Reconstitution of the Resident Hepatic Macrophage Pool by Cell Transplantation” LXIII Congresso Nazionale, Società Italiana di Anatomia e Istologia Torino, 10-12 Settembre 2009

Follenzi A., Merlin S, Brown B and Gupta S. Cell therapy with genetically-modified liver sinusoidal endothelial cells (LSEC) corrects bleeding phenotype of hemophilia A mice. 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, Boston, MA (October 30 November 2 2009).

Follenzi A. Transplanted Endothelial Cells Repopulate the Liver Endothelium and Correct the Phenotype of Hemophilia A Mice, XVI ESGCT Annual Meeting, Bruges, Belgium (13-16 November 2008)

Follenzi A., Sarkar R, Raut S and Gupta S. Bone Marrow Transplantation Corrects the Bleeding Phenotype of Hemophilia A Mice Through Reconstitution of FVIII Expression in Non Parenchymal Cells. 58th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4 2008).
 
Pubblicazioni
T cell receptor (TCR) gene transfer with lentiviral vectors allows efficient redirection of tumor specificity in naive and memory T cells without prior stimulation of endogenous TCR.
Hepatocyte transplantation-induced liver inflammation is driven by cytokines-chemokines associated with neutrophils and Kupffer cells.
EphrinB reverse signaling contributes to endothelial and mural cell assembly into vascular structures
The endogenous inhibitor of Akt, CTMP, is critical to ischemia-induced neuronal death.
Deletion of the ectodomain unleashes the transforming, invasive, and tumorigenic potential of the MET oncogene.
Lentivectors encoding immunosuppressive proteins genetically engineer pancreatic beta-cells to correct diabetes in allogeneic mice.