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Responsabile Luigia Grazia Fresu
Settore di ricerca Farmacologia
Personale docente Sandra Brunelleschi   
Personale non-docente Angela Amoruso  Claudio Bardelli  Alessandra Palma               
Obiettivi della ricerca 1) Studio della possibile influenza del genere sull’espressione di PPAR e sul release basale delle citochine in monociti/macrofagi da pazienti affetti da coronary heart disease (CHD).
Risultati ottenuti 1) E’ ampiamente dimostrato che i PPARs svolgono un ruolo importante nell’infiammazione e quindi nell’aterosclerosi, ma poco si sa su eventuali gender differences che possono in qualche modo influenzare la loro espressione e funzionalita’. Abbiamo quindi reclutato volontari sani e pazienti affetti da CHD, uomini e donne, da cui abbiamo isolato monociti; queste cellule sono state studiate come tali oppure sono state differenziate in macrofagi (monocytes-derived macrophages, MDM). Abbiamo quindi valutato i livelli basali di espressione di PPAR-alfa e –gamma, e il release di alcune citochine. I risultati hanno dimostrato che l’espressione di PPAR-gamma e’ significativamente piu’ elevata nei pazienti affetti da CHD rispetto ai volontari sani. Tra i pazienti affetti da CHD, le donne sono quelle con maggior espressione di PPAR-gamma rispetto agli uomini, e mostrano un minor rilascio basale di TNF-alfa e IL-6. Queste differenze possono in parte contribuire alla differente risposta di genere osservata dopo trattamento con alcuni attivatori PPAR. 
Obiettivi della ricerca 2) Effetti del fumo di tabacco sull`espressione di PPAR-gamma in pazienti affetti da coronary heart disease (CHD).
Risultati ottenuti 2) Abbiamo precedentemente dimostrato che i monociti/macrofagi isolati da volontari sani fumatori presentano livelli di espressione costitutiva di PPAR-gamma significativamente piu’ elevati rispetto ai non fumatori. Poiche’ il fumo rappresenta uno dei piu’ importanti fattori di rischio per coronary heart disease (CHD), abbiamo valutato l’espressione basale e la funzionalita’ di PPAR-gamma, e il rilascio di alcune citochine, in monociti/macrofagi isolati da pazienti affetti da CHD, stratificati in fumatori, non fumatori ed ex fumatori. I monociti sono stati testati come tali, differenziati in macrofagi a 4giorni (M4) o macrofagi completamente differenziati (MDM). Solo i M4 e gli MDM hanno presentato importanti differenze. Infatti nei pazienti affetti da CHD fumatori essi mostrano un livello significativamente ridotto di PPAR-gamma ma un rilascio basale di TNF-alfa e IL-6 aumentato rispetto ai non fumatori e agli ex fumatori. Invece, gli MDM degli ex fumatori presentano la piu’ alta espressione basale di PPAR-gamma e il piu’ basso release basale di citochine infiammatorie. Questi risultati ex vivo ottenuti dai pazienti CHD ex fumatori potrebbero in parte rappresentare un possibile meccanismo di protezione, capace di recuperare una normale reattivita’ cellulare. 
Obiettivi della ricerca 3) Ruolo della calcineurina nella migrazione dei cheratinociti
Risultati ottenuti 3) Risultati precedenti hanno mostrato che la migrazione dei cheratinociti e’ significativamente aumentata in presenza di FK506 sia durante il saggio che dopo tempi di incubazione piu’ lunghi e rimozione durante il saggio. Questo farebbe quindi pensare ad un effetto dovuto alla fosforilazione/defosforilazione di proteine direttamente coinvolte nel processo migratorio, ma anche ad un ruolo della calcineurina a livello trascrizionale nel processo. Questi risultati iniziali suggeriscono un nuovo meccanismo d’azione degli inibitori della calcineurina, che potrebbe essere responsabile del processo noto come wound healing, che potrebbe contribuire alla normalizzazione delle condizioni patologiche cutanee infiammatorie. Un effetto di questi farmaci quindi diretto sui cheratinociti e non sui linfociti. Scopo di questa ricerca e’ ora quello di indagare la via di segnale coinvolta nel processo migratorio dei cheratinociti, in quanto abbiamo gia’ visto che NFAT sembra non essere modulato durante la migrazione. Abbiamo transfettato sia le cellule HaCat che NHEK, trattate con FK506 e con TDZD (inibitore della GSK-3beta), con i seguenti geni reporter: pNFAT-Luc, pAP1-Luc, pSRE-Luc, pCRE-Luc, pC-MYB-Luc. Le cellule sono state transfettate con il gene reporter della luciferasi la cui espressione e` controllata dai fattori di trascrizione calcineurina-dipendenti su menzionati, e con il gene reporter della renilla, usato come controllo, controllato dal promotore della timidina kinasi dell’herpes simplex virus pRL-TK, come indice di un moderato livello di espressione. I risultati sono stati quindi espressi come % del controllo renilla come indicazione di un’attivazione basale del relativo promoter. In condizioni basali, cioè condizioni di non trattamento, NFAT e c-myb sono risultati non attivati, come dimostrato dall’assenza virtuale di espressione di luciferasi rispetto a renilla. L’attivazione di MEF, SRE e CRE e’ risultata molto debole, mentre AP1 e NF-kappaB avevano un’attivazione di circa il 10% rispetto a renilla. In ogni caso però, l’attività di nessuno di questi fattori veniva modificata dall’inibizione della calcineurina o della GSK-3. I dati suggeriscono quindi che la via di trascrizione attivata dalla calcineurina non è quella NF-AT-dipendente o dipendente dagli altri fattori di trascrizione tradizionalmente sotto controllo della calcineurina. E’ quindi di notevole interesse approfondire questi studi e individuare il meccanismo molecolare alla base dell’effetto della calcineurina sui keratinociti. 
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