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Responsabile Gianni Bona
Settore di ricerca Pediatria Generale e Specialistica
Personale docente Simonetta Bellone  Antonella Petri 
Personale non-docente Letizia Trovato  Stefania Moia  Stefania Riccomagno  Gillian E. Walker  Flavia Prodam  Arianna Busti  Silvia Savastio  Erica Grassino
Obiettivi della ricerca 1) Circonferenza vita e rischio metabolico in età pediatrica
Risultati ottenuti 1)  La Federazione Internazionale Diabete (IDF) ha definito i criteri per la diagnosi della sindrome metabolica nel bambino; la circonferenza addominale, come nell’adulto, sembra essere un fattore predittivo indipendente di insulino resistenza, alterati livelli lipidici e pressione arteriosa.
Scopo del lavoro è quello di valutare i fattori di rischio metabolico e il ruolo predittore della circonferenza vita in un gruppo di bambini obesi.
149 bambini obesi prepuberi sono stati sottoposti a misurazione di circonferenza vita, rilevazione di pressione arteriosa e valutazione del metabolismo basale. In 46 soggetti è stato eseguito carico orale di glucosio (OGTT): due mostravano glicemia a digiuno alterata (IFG), uno diabete mellito tipo 2 e due alterata tolleranza al glucosio (IGT). Sono stati riscontrati alterati livelli glicemici nel 3,4% dei pazienti, livelli di trigliceridi >150 mg/dl nel 2,0%, livelli di HDL <40 mg/dl nel 19,5%, PAOS >130 mmHg nel 14,1% , PAOD >85 mmHg nel 18,1%. Si è osservata una circonferenza vita di 83,3 ± 12,7 cm (media ± SD) in assenza di variazioni significative legate al sesso. La circonferenza vita correlava positivamente con BMI, PAOS e PAOD, indice HOMA, QUICKI, trigliceridi, insulina (IRI) a digiuno , a 60 e a 120 minuti durante OGTT. Quando pesata per BMI e BMI ed età, la circonferenza vita correlava significativamente con IRI T0 (Pearson=0.533; p<0.004), IRI T60 (0.376; p<0.005), IRI T120 (0.425; p<0.002), HOMA (0.578; p<0.002), mentre non risultavano significative le correlazioni con PAOS, PAOD, QUICKI, ISI. Nella regressione multipla il miglior predittore della circonferenza vita è stato l’HOMA (r2=0.317; p<0.001). CONCLUSIONI: Già in età prepubere l’obesità si associa a sindrome metabolica. La circonferenza vita risulta essere un buon predittore per riconoscere i bambini con alto rischio metabolico.
 
Obiettivi della ricerca 2) Polimorfismi del gene di ghrelin nella sindrome di Prader Willi
Risultati ottenuti 2)   La sindrome di Prader Willi (PWS) è una sindrome genetica caratterizzata da iperfagia, obesità e numerose altre alterazioni endocrinologiche, tra cui livelli aumentati di ghrelin. La causa di tale incremento come pure la modulazione della secrezione di ghrelin in condizioni di digiuno e di normo-alimentazione in rapporto ai parametri metabolici nei soggetti PWS non è stata ancora completamente chiarita. Si è dimostrato come numerosi polimorfismi del gene di ghrelin (GHRL) si associno con l’obesità, il diabete mellito di tipo 2 e l’ipertensione arteriosa. Non è ancora stato compreso appieno il ruolo fisiologico della regolazione dell’espressione del GHRL sia in condizioni normali sia patologiche quali la PWS.
A tale scopo abbiamo eseguito l’analisi mutazionale di GHRL in toto in 90 bambini non parenti normopeso (NP), 81 bambini obesi (OB) e 34 bambini o adulti PWS. Abbiamo, inoltre, valutato il metabolismo lipidico e glucidico a digiuno nei bambini e la tolleranza glucidica nei soggetti adulti PWS. Le varianti del pre-pro-GHRL e uno SNP della regione del promotore (rs26802) hanno mostrato frequenze alleliche simili tra NP, OB, e PWS. Tutti i PWS sono risultati portatori di un altro frequente polimorfismo SNP del promotore (rs27647) (p<0.002 e p<0.003 rispetto ai NP +OB e ai NP o OB da soli). Non si sono osservate differenze alleliche significative per il rs27647 tra NP e OB. Inoltre, la distribuzione del genotipo del rs26802 (A>C) è risultata significativamente differente tra i soggetti PWS adulti normoglicemici e diabetici (p<0.02). Non si sono osservate altre associazioni tra i polimofismsi del GHRL ed i parametri metabolici nei PWS.
Questi dati mostrano come i polimorfismi nella regione 5’ del GHRL sembrano distribuiti diversamente nei PWS rispetto alla popolazione normale e che potrebbero associarsi allo sviluppo del fenotipo diabetico nei soggetti adulti PWS.
 
Obiettivi della ricerca 3) Analisi molecolare dei geni SOCS2 e GH-R in pazienti con Bassa Statura Idiopatica
Risultati ottenuti 3)  I soggetti con bassa statura (BS) idiopatica possono mostrare un certo grado di insensibilità al GH dovuto sia a difetti a carico del recettore del GH (GH-R) sia ad alterazioni nella trasduzione del segnale di tale recettore. Recentemente è stato identificato un meccanismo di attenuazione del segnale del GH che coinvolge membri di una famiglia di proteine denominate “soppressori del segnale delle citochine” (SOCS).
Inizialmente lo scopo di questo lavoro è stato quello di ricercare mutazioni del gene SOCS2, mediante DHPLC e sequenziamento diretto, in un gruppo di 102 soggetti (56M/46F) con bassa statura, 87 prepuberi e 15 puberi, che mostravano un range di altezza: 3°-10° percentile, range di velocità di crescita: 25°-75° centile, ed età mediana pari a 10,4 anni (range: 3,1-14,3). In tutti i soggetti, sia la secrezione di GH sia di IGF-I risultavano nella norma.
Si è riscontrata la presenza di due SNPs già noti dalla letteratura: rs2200160 C→T ed rs1498708 C→T, in condizione sia di eterozigosi che di omozigosi, nel primo esone non codificante del gene. Inoltre, un nuovo SNP C→G in condizione di eterozigosi, in posizione -172 dal primo codone tradotto, è stato riscontrato in 3 soggetti. Le frequenze alleliche di tali SNPs sono risultate del tutto sovrapponibili a quelle trovate in un gruppo di 80 soggetti di controllo di statura normale e paragonabili per età, sesso e stadio puberale, essendo la frequenza di T per lo SNP rs2200160 pari a 0,13 e 0,15 e per lo SNP1498708 pari a 0,27 e 0,22 , rispettivamente nelle BS e nei controlli. Anche la frequenza di G in -172 da ATG è sovrapponibile tra BS e controlli, essendo rispettivamente pari a 0,015 e 0,01. In conclusione, le variazioni riscontrate non mostrano un’associazione significativa con la condizione di bassa statura; SOCS2, quindi, non sembra essere coinvolto nella patogenesi della BSI.
Successivamente, abbiamo eseguito l’analisi molecolare del gene GH-R in un gruppo di 45 soggetti con BSI (24M/21F), che presentavano livelli di IGF1 inferiori ai limiti di norma per l’età e con scarsa risposta alla terapia con GH.
In sintesi è stato possibile riscontrare la presenza di 5 polimorfismi (SNPs) già descritti, rs6179 (A/G) nell’esone 6; rs6176 (C/T), rs6180 (A/C) e rs6182 (G/T) nell’esone 10, tutti in condizioni sia di eterozigosi che di omozigosi; in cinque soggetti è stata trovata la delezione dell’esone 3. Le frequenze alleliche di questi SNPs risultano sovrapponibili a quelle trovate nel gruppo di controllo.
Inoltre in 30 soggetti è stata identificata una nuova delezione di una G nell’IVS7 del gene, in posizione -58 dall’ATG dell’esone 8, sia in eterozigosi che in omozigosi, con una frequenza per l’allele G di 0,53 e 0,58 rispettivamente nei pazienti e nei controlli.
In quattro soggetti è stata trovata la mutazione R179C in condizioni di eterozigosi, in posizione 535 nella regione codificante dell’esone 6. Questa singola mutazione non-sinonima determina una sostituzione aminoacidica Arg→Cys (CGC>TGC) in posizione 179 della proteina, a livello del dominio extracellulare del recettore; tale mutazione non è stata trovata nel gruppo di controllo.
L’aggiunta di una cisteina potrebbe determinare un cambiamento della struttura tridimensionale del recettore con conseguenze fenotipiche. Per verificare gli effetti di tale mutazione sulla struttura e sulla funzione del GH-R, e stabilirne la potenziale associazione alla BSI, sono in corso studi funzionali in vitro.
 
Obiettivi della ricerca 4) Caratterizzazione clinica e genotipica di pazienti affetti da ipopituitarismo isolato o multiplo e ricerca delle correlazioni tra genotipo e fenotipo
Risultati ottenuti 4)  Il presente studio è finalizzato all’identificazione delle basi molecolari dei difetti ipofisari su un’ampia casistica di soggetti con IGHD e CPHD, familiari e sporadici, non organici.
Tra i geni coinvolti nei difetti ipofisari e deputati all’organogenesi dell’adenoipofisi ed alle strutture della linea mediana (PIT1, PROP1, LHX4, LHX3 ed HESX1), oltre allo studio di HESX1 ed LHX4 già riportato precedentemente, è stato analizzato il gene LHX3.
Sino ad oggi la letteratura riporta complessivamente 13 mutazioni a carico del gene HESX1, sia a carattere dominante sia recessivo, 7 mutazioni in LHX3 a carattere recessivo e 5 mutazioni in LHX4 a carattere dominante.
La casistica considerata per l’analisi molecolare, eseguita tramite sequenziamento diretto e DHPLC, era costituita da 198 soggetti IGHD (125M/73F) e 114 soggetti CPHD (68M/46F), di cui l’80% era di tipo sporadico ed il 20% era di tipo familiare.
Per il gene HESX1, analizzato sia nei CPHD sia negli IGHD, tra le variazioni già riportate (Gln6His, Ala46Val e Val129Ile) ed i polimorfismi noti (Asn125Ser e His61His), è stato condotto uno studio funzionale sulla sostituzione nucleotidica c357 +3G>A in IVS2 in condizione di eterozigosi, trovata in un bambino affetto da IGHD e senza alterazioni ipofisarie. Lo studio in vitro per verificare i meccanismi di splicing del gene, ha messo in luce la presenza di due trascritti alternativi oltre a quello che porta alla produzione della proteina corretta costituita da 185 aminoacidi. La variazione c357 +3G>A in IVS2, invece, renderebbe il sito donatore GT più protetto per il corretto splicing e non permetterebbe la formazione di uno dei due trascritti alternativi.
Per il gene LHX4, analizzato nei CPHD, restano invariati i dati precedenti, in cui sono state riscontrate 2 variazioni sinonime: Gly21Gly nell’esone 1 e Asp128Asp nell’esone 3, ed il polimorfismo noto Asp328Ser nell’esone 6 (rs7536561).
Per il gene LHX3 sono stati analizzati 98 (…M/…F) soggetti affetti da CPHD. Fino ad ora non sono state trovate mutazioni causali, ma solo polimorfismi già noti da GenBank, nell’esone 1b (Ala27Ala - rs2274116) e nell’IVS1 (C>T in +19 - rs2275115) oppure variazioni non ancora riportate, quali la mutazione sinonima Pro273Pro in 1 paziente e la sostituzione aminoacidica Arg315Pro in 2 pazienti, la cui frequenza allelica (allele con la variazione: 1%) è del tutto sovrapponibile a quella trovata in un gruppo di controlli sani (0,5%).
Saranno necessari ulteriori studi di tipo funzionale per stabilire se le variazioni che provocano una sostituzione aminoacidica abbiano un effetto negativo sulla funzionalità proteica, e quindi siano causali della malattia.
 
Obiettivi della ricerca 5) Analisi molecolare e studio di funzione del gene del recettore del TSH (TSH-R) in soggetti con ipotiroidismo subclinico
Risultati ottenuti 5)  L’ipotiroidismo subclinico è una condizione in cui si riscontra un innalzamento dei livelli sierici di TSH associato a livelli di ormoni tiroidei nella norma. Nel bambino l`ipotiroidismo subclinico è condizione rara, la sua prevalenza non è nota ed eziologia e strategie terapeutiche sono in parte diverse rispetto all`adulto; i soggetti affetti presentano tiroide in sede, di dimensioni normali, con caratteristiche ecografiche nella norma, in assenza di segni ecografici e bioumorali di autoimmunità tiroidea.
Negli ultimi anni sono state identificate nell’uomo numerose mutazioni puntiformi localizzate nelle regioni codificanti del gene del recettore dell’ormone tireotropo o TSH (TSH-R) risultate responsabili di vari difetti strutturali nella proteina da esso prodotta. Inoltre sono stati identificati un elevato numero di polimorfismi di un singolo nucleotide (single nucleotide polymorphism SNP) e microsatelliti. In particolare mutazioni germinali causanti perdita di funzione nel gene del TSH-R sono state spesso riconosciute come causa genetica dell’ ipotiroidismo subclinico.
Il TSH è prodotto dall`ipofisi anteriore e il suo ruolo è sostanzialmente quello di regolare la proliferazione delle cellule della tiroide e mantenere nei livelli fisiologici la produzione degli ormoni tiroidei. Il recettore è localizzato sulla membrana basolaterale delle cellule follicolari della tiroide, appartiene alla superfamiglia di recettori accoppiati a proteine G e presenta la classica struttura a sette domini transmembrana.
Il gene per il TSH-R è localizzato sul cromosoma 14q31, è composto da 10 esoni e codifica per una proteina di 764 aa; è caratterizzato da un segmento aminoterminale glicosilato responsabile del legame ad alta affinità con l’ormone (esoni 1-9), mentre l’esone 10 codifica per i sette domini transmembrana e la coda citoplasmatica.
Nel nostro studio sono stati reclutati 88 pazienti (M/F:45/43, range: 1-18 anni, età media 8.2) affetti da ipotiroidismo subclinico; tutti i soggetti mostravano in almeno due misurazioni valori di TSH superiori alla norma e valori normali di ormoni tiroidei. I soggetti presentavano inoltre tiroide in sede, di dimensioni normali, con caratteristiche ecografiche nella norma. Sono stati esclusi tutti i pazienti positivi per la presenza di anticorpi diretti contro epitopi tiroidei oppure affetti da patologie correlabili alla tiroide.
Per l’analisi molecolare il campione era costituito da DNA genomico estratto da sangue periferico. I dieci esoni del gene del TSH-R sono stati amplificati, visualizzati su gel di agarosio e successivamente sottoposti ad analisi dHPLC (denaturing High Performance Liquid Chromatography). Ogni frammento è stato introdotto in colonna a due diverse temperature sia come singolo campione sia miscelato con un riferimento per evidenziare eventuali variazioni nel profilo di eluizione rispetto ad un frammento wild-type precedentemente sequenziato; I campioni che sono risultati positivi al pre-screening dHPLC sono stati sottoposti al sequenziamento automatico.
Nel nostro gruppo di pazienti sono state identificate 19 variazioni note: 3 mutazioni sinonime (P119P, G245G e A459A), 6 mutazioni missenso (C41S, R109Q, P162A, D403N, W488R e M527T), 1 inserzione (123-124insTGCA), 1 delezione (555-561delTATTCTT) e 8 polimorfismi (P27T, P52T, IVS1+63, IVS1-80, IVS6+13, N187N, [CT]n microsatellite e D727E ). Tutte le variazioni sono state individuate in condizione di eterozigosi.
E’ stata inoltre identificata una nuova mutazione (TGG → TAG) in posizione 1559 nell’esone 10. Essa è localizzata nel terzo dominio transmembrana del recettore e causa la sostituzione dell’aminoacido triptofano con un codone di stop (W520X); sia la paziente che la madre sono eterozigote per la mutazione mentre il padre è omozigote per l’allele wild-type. La mutazione causa una prematura interruzione nella sintesi dell’mRNA del TSH-R e il suo effetto sarà pertanto oggetto di successivi studi funzionali.

 
Collaborazioni in atto nessuna 
Comunicazioni a congressi
1. S. Bellone, S. Savastio, S. Mura, G. Di Dio, S. Giacoma, F. De Rienzo, C. Malandra, A. Petri, F. Prodam, G. Corneli, G. Aimaretti, G. Bona. Valutazione della sensibilità insulinica in bambini affetti da deficit di GH all’inizio e al termine della terapia con rhGH. 3 rd Incontro Italiano sulle Malattie Ipotalamo-Ipofisarie Catania, 14-16 febbraio 2008.

2. S. Savastio, S. Bellone, J. Bellone, F. Zanetta, G. Di Dio, S. Giacoma, A. Petri, F. Prodam, G. Corneli, G. Bona & G. Aimaretti. Evaluation of insulin sensitivity in Growth Hormone (GH) deficient children before and at the end of rhGH therapy. 10th Congresso Europeo di Endocrinologia (ECE), Berlino, 3–7 maggio 2008.

3. F. Prodam, S. Bellone, G. Corneli, F. De Rienzo, S. Giacoma, A. Rapa, D. Vivenza, G. Grugni, A. Crinò, E. Di Battista, G. Bona. Ghrelin gene polymorphisms in Prader Willi Syndrome. 10th Congresso Europeo di Endocrinologia (ECE), Berlino, 3–7 maggio 2008.

4. IM. Bonsignori, EC. Grassino, S. Bellone, F. Cadario, F. De Rienzo, A. Petri, F. Prodam, G. Bona. Tiroidine cronica associata a vitiligine e diabete mellito di tipo 1 in età pediatrica: un caso di poliendocrinopatia autoimmune di III tipo. 64th Congresso Nazionale della Società Italiana di Pediatria (SIP), Genova, 15-18 ottobre 2008.

5. EC. Grassino, IM. Bonsignori, F. De Rienzo, A. Petri, G. Corneli, S. Bellone, F. Prodam, G. Bona. Circonferenza vita e rischio metabolico in età pediatrica. 64th Congresso Nazionale della Società Italiana di Pediatria (SIP), Genova, 15-18 ottobre 2008.

6. IM. Bonsignori, EC. Grassino, F. De Rienzo, F. Prodam, F. Cadario, S. Bellone, A. Petri, G. Bona. Efficacia di un training dietetico sul profilo lipidico in una popolazione diabetica in età pediatrica. 15 th Congresso Nazionale della Società Italiana di Medicina dell’Adolescenza (SIMA), Rende, 23-25 ottobre 2008.

7. F. De Rienzo, EC. Grassino, IM. Bonsignori, M. Giordano, G. Corneli, F. Prodam, S. Bellone, A. Petri, G. Bona. Studio delle mutazioni di fattori trascrizionali coinvolti in difetti combinati di ormoni ipofisari. 15 th Congresso Nazionale della Società Italiana di Medicina dell’Adolescenza (SIMA), Rende, 23-25 ottobre 2008.

8. Usefulness of waist circumference measurement to identify children with high metabolic risk. Bellone S, Prodam F, Di Dio G, Giacoma S, Zanetta F, Savastio S, De Rienzo F, Malandra C, Petri A, Corneli G, Bona G. 90th annual meeting of Endocrine Society, June, San Francisco, California, 15-18 Giugno 2008.

 
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