Salta ai contenuti. | Salta alla navigazione

Strumenti personali

sito non più aggiornato
 

Sezioni

Tu sei qui: Home / Ricerca / 2008

Responsabile Maria Prat
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Antonia Follenzi   
Personale non-docente Stefano Pietronave  Deborah Locarno  Serena Nano  Andrea Zamperone  Simone Merlin  Aulicino Aida      
Obiettivi della ricerca 1) Analisi del potenziale oncogenico di forme tronche di Met prive dell’ectodominio.
Risultati ottenuti 1) Questo proto-oncogene può acquisire potenziale oncogenico con meccanismi diversi: riarrangiamento genico, amplificazione, iperespressione, mutazione puntiforme ed espressione ectopica, che risultano in una sua attivazione costitutiva. Abbiamo ora dimostrato che in fibroblasti murini esprimenti la forma tronca di Met priva dell’ectodominio, a seguito di infezione con un vettore Lentivirale, la proteina Met e i trasduttori MAPK e Akt sono costitutivamente attivati. Queste cellule crescono in modo indipendente da ancoraggio, invadono una matrice extracellulare che riproduce la membrana basale e, se inoculate sottocute in topi nudi, provocano tumori palpabili. Si ipotizza quindi che in condizioni fisiologiche l`ectodominio di Met giochi il ruolo di regolatore negativo dell`attività del recettore (Merlin et al. Cancer Sci. doi: 10.1111/j.1349-7006.2008.01079.x) 
Obiettivi della ricerca 2) Analisi del potenziale anti-apoptotico di anticorpi monoclonali agonisti del recettore Met su cardiomiociti
Risultati ottenuti 2)  L’HGF, un fattore pleiotropico con attività mitogenica, motogenica, morfogenica e anti-apoptotica su diversi tipi cellulari, ha un effetto positivo sul miocardio. Poiché tutte le risposte biologiche evocate da HGF sono mediate dal suo recettore, abbiamo utilizzato anticorpi monoclonali (mAb) agonisti del recettore come fattori anti-apoptotici per le linee miocardiche H9c2 e HL-5 di roditore. Gli anticorpi proteggono dall’apoptosi indotta da stress ossidativo dovuto a trattamento transiente con H2O2 sia secondo parametri morfologici (formazione di corpi apoptotici, condensazione del DNA), che biochimici (positività all’Annexin V, traslocazione di bax ai mitocondri, attivazione di caspasi, frammentazione del DNA), in modo MAPK Erk1/2 e PI 3-kinase dipendente. In queste cellule l’anticorpo può quindi essere un valido sostituto dell’HGF, con i vantaggi di essere molto più stabile, facilmente ottenibile in forma attiva e altamente pura (Pietronave et al., American Journal of Physiology, Heart and Circulation Physiology, in revisione).  
Obiettivi della ricerca 3) Analisi del potenziale anti-apoptotico di anticorpi monoclonali agonisti del recettore Met su epatociti in vitro e del loro potenziale cardioprotettivo in vivo.
Risultati ottenuti 3) Il fattore di crescita epatocitario (HGF) ha un effetto benefico sull’omeostasi del fegato, soprattutto come fattore mitogenico, anti-apoptotico e anti-fibrotico. Fattori limitanti l’uso di HGF in vivo sono il fatto che sono state riportate: i) una correlazione positiva tra infiammazione del fegato, stato fibrotico avanzato e alta concentrazione di HGF, ii) insorgenza di effetti avversi in organi extra-epatici, iii) la possibilità che in situazioni particolari l’HGF promuova tumorigenesi; iv) la sua breve emivita in vivo. Abbiamo quindi utilizzato due anticorpi monoclonali (mAb) agonisti completi o parziali del recettore per HGF per proteggere epatociti primari di ratto e una linea di epatoblasti murini da apoptosi indotta da ipossia (trattamento con CoCl). Esperimenti in vitro hanno dimostrato che i) i mAb riconoscono il recettore su queste cellule, lo attivano inducendone la fosforilazione in tirosina e attivando due trasduttori coinvolti nella proliferazione e sopravvivenza cellulare (Erk1/2 e Akt); ii) a concentrazioni nanomolari i due MAb proteggono da apoptosi, rilevata in citofluorimetria, allo stesso livello di HGF, usato come controllo. Gli anticorpi modulano negativamente l’attività delle caspasi 3 e 9, enzimi effettori dell’apoptosi. Esperimenti preliminari effettuatti in vivo hanno dimostato che i) i mAb hanno effetto epatoprotettivo in topi C57/B6 in cui si induce epatotossicità acuta (trattamento con CCl4; valutazione del danno su sezioni istologiche di fegato e riduzione del livello serico della ALT). [Ricerca in collaborazione con il Prof. Valente - Anatomia Patologica].  
Obiettivi della ricerca 4) Ruolo del microambiente nel differenziamento di cellule staminali adulte da tessuto adiposo (ADSC) verso fenotipi diversi.
Risultati ottenuti 4) È noto che la frazione stromale del tessuto adiposo contiene una riserva di cellule indifferenziate con alto potenziale differenziativo. ADSC sono state per ora ottenute da tessuto adiposo murino della regione inguinale, e dal tessuto adiposo epicardico di maiale e di uomo (ottenuto il consenso informato), con metodiche classiche, e sono state mantenute in coltura cellulare per un certo numero di passaggi (fino al 26°). Le cellule sono state caratterizzate per il fenotipo biochimico (marcatori di staminalità quali Sca-1, Kit, …), capacità di proliferare (cinetiche di doubling times), e multipotenzialità (induzione al differenziamento osteogenico, adipogenico, endoteliale).
È stata ottenuta una linea che mantiene le caratteristiche biochimiche originali testate, che è arrivata al passaggio 27 (circa 6 mesi di coltura) e che mantiene la multipotenzialità. Sono in corso esperimenti di caratterizzazione analoga per le cellule derivate dall’epicardio di maiale e di uomo. È previsto che in futuro si utilizzi come sorgente di ADSC materiale ottenuto da liposuzioni. Questa ricerca pone le basi per un progetto che prevede di indurre ADSC al differenziamento miocardico inserendole in strutture 3D, in presenza di fattori di crescita/sopravvivenza/differenziamento e molecole di adesione (progetto in collaborazione con Politecnico di Milano).
 
Obiettivi della ricerca 5) Produzione di anticorpi monoclonali diretti contro epitopi del dominio extracellulare del recettore Met tramite la tecnica del “phage display”.
Risultati ottenuti 5)   Si è prodotta una libreria di anticorpi in formato scFv (single chain Fragment variable) a partire dai geni di immunoglobuline espressi nei linfociti splenici di topi immunizzati contro il recettore Met. Da questa verranno selezionati anticorpi diretti verso epitopi diversi del recettore. Le molecole così selezionate verranno quindi ingegnerizzate in formati diversi (essenzialmente bivalenti, quali “diabodies” o “minibodies”), in modo da indurre la dimerizzazione del recettore e perciò essere in grado di attivarlo, come gli anticorpi convenzionali. Questi anticorpi di nuova generazione presenteranno i seguenti vantaggi rispetto al ligando naturale HGF: maggiore stabilità, minori costi, possibilità di indurre una risposta biologica parziale (ad esempio: solo protezione e differenziamento, ma non proliferazione). Inoltre, rispetto agli anticorpi convenzionali presenteranno i seguenti vantaggi: essendo dotati di minor massa (circa 50-75 kDa contro 150 kDa) ed essendo monocatenari, a) essi consentono una più facile produzione in cellule procariote su larga scala e con costi minori e b) hanno migliore capacità di penetrazione in strutture tridimensionali. Infine gli anticorpi ricombinanti prodotti da librerie di geni umani sono completamente umani e perciò privi di immunogenicità, qualora se ne prospetti un potenziale uso terapeutico in vivo (progetto in collaborazione con Prof Sblattero – Biologia Applicata) .  
Collaborazioni in atto Ermanno Gherardi
Medical Research Council Centre,
Hills Road, Cambridge CB2 2QH,
United Kingdom
egherard@mrc-lmb.cam.ac.uk
 
Comunicazioni a congressi - Giancarlo Forte, Stefano Pietronave, Paolo Di Nardo and Maria Prat
Clonally expanded Sca-1pos mesenchymal stem cells spontaneously generate undifferentiated phenotypes in vitro.
Abcam Meeting: Stem cells and epigenetics, London, 2008.

- S. Pietronave, G. Baldanzi, F. Chianale, D. Locarno, P. Porporato, A. Zamperone, A. Graziani, M. Prat
ROLE OF DIACYLGLYCEROL KINASE-ALPHA IN HGF-DEPENDENT BIOLOGICAL EFFECTS OF KAPOSI’S SARCOMA
Spring 2008 ABCD Meeting – Mechanisms of Signal Transduction in Cell Adhesion and Differentiation, Pontignano (SI), 2008.

- Cantelmo AR, Morini M, Pietronave S , Cammarota R , Prat M, Albini A
Peptide Mimicking the Met Receptor Multifunctional Docking Site Impairs in vitro HGF-Dependent Responses and in vivo Kaposi Sarcoma Growth
Spring 2008 ABCD Meeting – Mechanisms of Signal Transduction in Cell Adhesion and Differentiation, Pontignano (SI), 2008.

- Vilela-Silva AC, Pagliari S, Forte G, Franzese O, Pietronave S, Fiaccavento R, Pagliari F, Carotenuto F, Prat M, Minieri M, Di Nardo P. Cardiomyocyte co-cultures to assess the cardiomyogenic potential of adult stem cell lines.
XV Congresso Nazionale della Società Italiana di Ricerche Cardiovascolari, Imola (BO), 2008.

- Pietronave S, Quirici N, Battistella E, Foltran I, Zamperone A, Rimondini L, Prat M
Epicardial adipose tissue on collagen scaffolds as potential strategies for tissue engineering
V Workshop delle Unità Operative dell’Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari, Torino, 2008.

- Fiaccavento R, Forte G, Pagliari S, Carotenuto F, Franzese O, Pietronave S, Prat M, Minieri M, Di Nardo P
Interaction between mesenchymal, cardiac stem cells and biomimetic microspheres
V Workshop delle Unità Operative dell’Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari, Torino, 2008.

- Vilela-Silva AC, Pagliari S, Forte G, Franzese O, Pietronave S, Fiaccavento R, Pagliari F, Carotenuto F, Prat M, Minieri M, Di Nardo P
Neonatal Cardiomyocyte co-cultures to assess cardiomyogenic potential of stem cell lines
V Workshop delle Unità Operative dell’Istituto Nazionale per le Ricerche Cardiovascolari, Torino, 2008.
 
Pubblicazioni