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Responsabile Antonia Follenzi
Settore di ricerca Istologia
Personale docente Maria Prat   
Personale non-docente Simone Merlin  Ester Borroni  Valentina Bruscaggin  Maria Feola  Diego Zanolini  Letizia Krizmancic      
Obiettivi della ricerca 1) Caratterizzazione di un promotore specifico per l`espressione di transgeni mediante vettori lentivirali nelle cellule dendritiche
Risultati ottenuti 1) Lo scopo di questo progetto è stato quello di ottenere un sistema di espressione regolato a livello trascrizionale in cui transgeni di interesse sono espressi in maniera specifica nelle cellule dendritiche. L’estremità 3’ del promotore per il CD11c murino è stato clonato per PCR a partire da DNA genomico di topo. Una volta amplificato è stato inserito in un costrutto lentivirale al 5’ della GFP e si è analizzata l`espressione cellulo-specifica in un pannello di linee cellulari ematopoietiche e non. In seguito abbiamo eseguito dei trapianti di midollo in topi riceventi irradiati letalmente con progentori midollari trasdotti con il vettore LV-CD11c.GFP per studiare la regolazione in vivo della trascrizione della GFP da parte di tale promotore. Come controllo abbiamo preparato delle chimere con cellule trasdotte con vettori in cui la GFP era sotto il controllo del promotore ubiquitario fosfoglicerato chinasi (PGK). Dopo 2 mesi i topi chimerici sono stati iniettati con un melanoma B16 in cui il GM-CSF è sovra-espresso ed ha indotto l’espansione delle cellule dendritiche. Abbiamo poi analizzato l’espressione della GFP nelle cellule dendritiche di sangue periferico, midollo osseo e milza dei topi iniettati e non iniettati con il tumore. L’espressione della GFP era localizzata nelle cellule di origine mieloide e in particolare nelle cellule dendritiche dei topi chimerici con il vettore contenente il promotore CD11c. Negli stessi topi, significativa è stata l’assenza di espressione della GFP nelle cellule di origine linfoide. Mentre l’espressione è stata ubiquitaria in tutte le cellule del sangue nei topi chimerici le cui cellule del midollo sono state trasdotte con il vettore contenente il promotore ubiquitario. 
Obiettivi della ricerca 2) Ripopolamento del pool macrofagico residente nel fegato mediante trapianto di cellule di Kuppfer e/o di macrofagi differenziati dal midollo
Risultati ottenuti 2) In questo primo anno abbiamo ottimizzato il protocollo per isolare le cellule di Kupffer (CK) del fegato dopo perfusione è la selezione positiva con l’anticorpo antiCD11b e i nostri studi sono stati eseguiti trapiantando 1X106 CD11b+ KC. Questi studi sino stati fatti utilizzando come topi donatori i topi transgenici GFP nel background C57Bl6, che esprimono questa proteina marcatrice in tutte le cellule. Mentre i topi riceventi erano comuni C57Bl6 di circa 8 settimane. I topi sono stati uccisi i fegati fissati in paraformaldeide e mediante immunofluorescenza con un anticorpo anti-GFP e anti-KC (F4/80) si sono contate le cellule che hanno attecchito nel fegato dei topi iniettati per via intraportale e per via endovenosa. Abbiamo stabilito che la via migliore per trapiantare le CK è la attraverso la vena porta e abbiamo dato che un numero maggiore delle cellule trapiantate localizza nel fegato del topo ricevente mentre attraverso iniezione intravenosa il numero di cellule che si ritrovano nel fegato dopo una settimana è decisamente inferiore.
b) studi sull’attecchimento e la proliferazione delle cellule trapiantate dopo la somministrazione di cloruro di gadolinio (GdCl3), protocollo utile per eliminare la popolazione nativa di CK.
Per stabilire se la deplezione dei macrofagi nei topi riceventi le CK trapiantate potesse influenzare il loro attecchimento abbiamo trattato i topi riceventi con un tipico agente che elimina le CK del fegato, cloruro di Gadolinio (50mg/kg) 24 ore prima del trapianto. Le cellule GFP e F4/80 positive erano presenti in entrambi i gruppi dei topi trapiantati con o senza GdCl3 ma l’attecchimento delle CK nei topi trattati con cloruro di Gadolinio era di 2 volte superiore. Tutte le nostre conte sono state effettuate contando le cellule positive per la GFP che co-localizzavano per F4/80. In 100 campi consecutivi ad un ingrandimento di 200X nei fegati dei topi trapiantati (sono stati usati 3 topi per condizione).
Abbiamo, inoltre, trapiantato i macrofagi derivati dal midollo osseo dopo differenziazione in vitro per una settimana in presenza di M-CSF nel mezzo di coltura. Incredibile queste cellule dopo trapianto nella vena porta in topi trattati o meno con GdCl3 erano presenti dopo 2 ore ma a 24 ore dal trapianto erano scomparse dal fegato dei topi trapiantati.
Bisogna sottolineare che la GFP è un ottimo marcatore per individuare le cellule trapiantate ma ha lo svantaggio che induce una risposta immune nei topi riceventi per cui le cellule trapiantate sono visibili solo temporaneamente per periodi non superiori ad una settimana. Per questa ragione negli esperimenti in cui abbiamo valutato la presenza delle CK per periodi superiori ad una settimana abbiamo usato un diverso modello animale come i topi che esprimono un’isoforma del marcatore CD45 (CD45.1) comune a tutte le cellule ematopoietiche che si distingue benissimo mediante l’uso di un anticorpo specifico. Mediante immunofluorescenza abbiamo confermato la presenza di KC in topi riceventi CD45 un mese dopo il trapianto. In futuro valuteremo se le cellule che attecchiscono sono in numero sufficiente ad espletare una funzione terapeutica. 
Obiettivi della ricerca 3) Trasferimento genico mediante vettori lentivirali in cellule endoteliali del fegato per la terapia dell’emofilia
Risultati ottenuti 3) Il ripopolamento del fegato con cellule dei sinusoidi epatici (LSEC) trasdotte con i vettori lentivirali (VL) può essere uno strumento utile per comprendere la biologia di queste cellule e il loro potenziale terapeutico in alcune malattie. Noi siamo interessati alla terapia genica dell’emofilia A. Abbiamo preparato i costrutti di trasferimento che esprimono la forma canina del Fattore VIII della coagulazione (FVIIIc) sotto il controllo di un promotore ubiquitario (PGK, fosfoglicerato kinasi-1) ed uno endotelio-specifico (vascular endothelial-cadherin, VEC). In questo progetto nell’anno trascorso abbiamo valutato: 1. l’efficienza di trasduzione di LSEC isolate da topi emofilici, l’espressione e l’attività del FVIIIc prodotto in vitro. Mentre adesso 2. stiamo valutando la funzionalità delle cellule LSEC emofiliche geneticamente modificate e trapiantate nel fegato dei topi emofilici e in particolare a) se integrano e proliferano nel parenchima epatico, b) se sono in grado di correggere il fenotipo nei topi emofilici e infine c) comprendere se l’espressione di FVIIIc espresso nelle LSEC mediante i VL scatena risposte immuni nel ricevente che potrebbero portare all’eliminazione delle cellule trapiantate. Quest’anno abbiamo anche modificato i nostri costrutti mediante l’aggiunta di una sequenza (Mir-142-3p) che inibendo l’espressione del nostro transgene (cFVIII) nelle cellule ematopoietiche, dovrebbe eliminare i problemi di risposta immune che potrebbero sorgere per l’espressione di una proteina che normalmente è assente nel topo ricevente (costrutto ottenuto dal prof. Naldini, TIGET, Milano).
Abbiamo concluso la prima fase in cui abbiamo verificato che le LSEC trasdotte mediante i vettori LV con il promotore PGK e con il promotore VEC producono FVIII. Abbiamo verificato questo sia per RT-PCR che per quantificazione del FVIIIc prodotto e per attivita’ specifica presente nel mezzo di coltura dopo 4 giorni dalla trasduzione. Nella fase 2, le LSEC trasdotte sono state trapiantate nei topi emofilici. Nei topi trapiantati un campione di sangue e’ stato prelevato a diversi intervalli di tempo (4-8 settimane). Alla fine dell’esperimento abbiamo saggiato la sopravvivenza dei topini trapiantati dopo saggio di sanguinamento e abbiamo avuto 5 sopravvissuti su 8 topi trapiantati e saggiati.I topi saranno uccisi e i fegati analizzati per verificare la presenza delle cellule positive per FVIIIc per immunofluorescenza e per RT-PCR. In questa fase stiamo valutando anche l’eventuale risposta immune contro il FVIIIc paragonando topi iniettati con il VL con o senza la sequenza Mir-142-3p.
Da questo progetto ci aspettiamo di ottenere informazioni cruciali riguardo al potenziale terapeutico delle LSEC trasdotte dai VL per la terapia dell’emofilia. Con l’espressione mirata di FVIII nelle LSEC avremo la produzione di questo fattore nelle stesse cellule in cui è prodotto il fattore di von Willebrand (FvW), fattore che prolunga l’emivita di FVIII nel sangue. Il FVIII inoltre verrà prodotto in un contesto cellulare che potrebbe indurre tolleranza al transgene. È infatti noto che le LSEC possono funzionare da “antigen presenting cells” (APC) non professionali e gli antigeni presentati ai linfociti dalle LSEC inducono tolleranza del transgene piuttosto che una risposte immune che potrebbe portare all’eliminazione del prodotto genico e delle cellule trasdotte.
 
Obiettivi della ricerca 4) terapia genica della Beta-thalassemia con iperespressione della transferrina mediante mediante l’uso dei vettori lentivirali
Risultati ottenuti 4) L`attuale terapia per la cura della beta-talassemia major include continue trasfusioni per sopprimere l’espansione di eritropoiesi extra-midollare, seguita dalla terapia chelante il ferro per bilanciarne l’accumulo causato dalle continue trasfusioni. Progressi sono necessari per comprendere i meccanismi alla base dello squilibrato metabolismo del ferro oltre che comprendere come il ferro endogeno può raggiungere i siti di attiva eritropoiesi. Siamo interessati al coinvolgimento della transferrina perché è il maggior trasportatore di ferro nell’eritropoiesi midollare.
Si intende dimostrare che l’iperespressione cronica di transferrina umana (hTf) è in grado di far regredire l’anemia e l’eccesso di ferro accumulato nei topi -talassemici. Utilizzeremo i topi Hbbth1/th1 un comune modello murino di talassemia intermedia caratterizzata da anemia, reticolocitosi, splenomegalia, EEM nel fegato e una sopravvivenza ridotta dei globuli rossi.
Gli obiettivi sono suddivisi in: A) Generazione e saggio in vitro dei costrutti lentivirali esprimenti la hTf; B) Valutazione delle funzioni fisiologiche della hTf quando espressa in vivo; C) Definire l’effetto a lungo termine dell’espressione della hTf verso l’anemia e l’eccesso di ferro presenti nei topi talassemici.
Al momento abbiamo clonato il cDNA della hTf nei costrutti lentivirali ed abbiamo verificato la sequenza del costrutto e l`espressione della proteina mediante Western Blot in cellule bersaglio trasdotte con il vettore lentivirale in cui la hTf è espressa sotto il controllo del promotore PGK. Abbiamo intenzione di preparare LV-hTF per saggiare in vivo il potenziale effetto terapeutico della iperespressione di transferrina nei topi talassemici. 
Collaborazioni in atto Sanjeev Gupta, MD
Albert Einstein College of Medicine, Liver Research Center, Dept Medicine & Pathology
Bronx 10461, NY

Nancy Carrasco, MD
Albert Einstein College of Medicine, Liver Research Center, Dept of Molecular Pharmacology, Bronx 10461, NY

Laura Santambrogio, MD, PhD
Albert Einstein College of Medicine, Dept of Pathology
Bronx 10461, NY

Harris Goldstein, MD
Albert Einstein College of Medicine, Dept of Microbiology and Immunology
Bronx 10461,NY

Giovanna Tosato,PhD e Ombretta Salvucci, PhD
Basic Research Laboratory (BRL,)Molecular and Cell Biology Section, National Cancer Institute, NIH 9000 Rockville Pike Bethesda, MD 20892

Suzanne R. Zukin,PhD.
Albert Einstein College of Medicine, Dominick P. Purpura Department of Neuroscience, Bronx 10461, NY  
Comunicazioni a congressi A. Follenzi. Transplanted Endothelial Cells Repopulate the Liver Endothelium and Correct the Phenotype of Hemophilia A Mice. Ninth Workshop on Novel Technologies and Gene Transfer for Hemophilia sponsored by the National Hemophilia Foundation. 22-23 February 2008, The Children`s Hospital of Philadelphia (PA), United States.

O. Salvucci, D. Maric, A. Follenzi and G. Tosato. Requirement for ephrinB activation in mural cells association with endothelial cells during new vessel formation. 99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research (AACR) April 12-16 2008 San Diego, CA.

A. Follenzi, S. Merlin, K. Bhargava, C. Palestro and S. Gupta. Reconstitution of the Resident Hepatic Macrophage Pool by Cell Transplantation. 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4, 2008).

A. Follenzi, Y. Wu, D. Spray and S. Gupta Restoration of Gap Junctions after Hepatocyte Transplantation is Necessary for Transplanted Cell Proliferation and Liver Repopulation. 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4, 2008).

M. Kumar, A. Follenzi and S. Gupta. Efficacy of RNAi Constructs for Inhibiting Hepatitis B Virus Replication has Implications for Antiviral Cell and Gene Therapy.59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4, 2008).

A. Follenzi, R. Sarkar, S. Raut and S. Gupta. Bone Marrow Transplantation Corrects the Bleeding Phenotype of Hemophilia A Mice Through Reconstitution of FVIII Expression in Nonparenchymal Cells. 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4, 2008).

X. Wang, R. Moitra, A. Follenzi, Y. Chen, J. Ding, J. Jiang, N. Roy-Chowdhury and J. Roy-Chowdhury.Long-term amelioration of jaundice in the Gunn rat model of Crigler-Najjar syndrome type 1 by lentiviral vector based systemic gene delivery: transcriptional restriction of transgene expression to hepatocytes limits host immune response to UGT1A1 59th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, San Francisco, CA (November 1–4, 2008)

S. Gardenghi, M.F. Marongiu, K. Muirhead, P. Ramos, C.N. Roy, N.C. Andrews, E. Nemeth, A. Follenzi, E. Rachmilewitz, P. Giardina, R. W. Grady and S. Rivella. Increased Hepcidin Expression in Mice Affected by β-Thalassemia Reduces Iron Overload with No Effect on Anemia. 50th Annual Meeting of American Society of Hematology, Dec 6-9 2008 San Francisco, CA.


 
Pubblicazioni
Dopamine-modified alpha-synuclein blocks chaperone-mediated autophagy.
Lentiviral vectors encoding human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-specific T-cell receptor genes efficiently convert peripheral blood CD8 T lymphocytes into cytotoxic T lymphocytes with potent in vitro and in vivo HIV-1-specific inhibitory activity.
Early cellular changes after blockage of chaperone-mediated autophagy.
Transplanted endothelial cells repopulate the liver endothelium and correct the phenotype of hemophilia A mice
Phenotype reversion in fetal human liver epithelial cells identifies the role of an intermediate meso-endodermal stage before hepatic maturation
Lentiviral Vectors for Cancer Gene Therapy